作者：樊涛，丁惠强，王拯，黑龙]
【摘要】 ：目的 探讨Caspase-1及其激活的细胞因子白细胞介素-18（Interleukin-18， IL-18）在大鼠急性脊髓组织损伤（SCI）后的表达及意义。方法 成年雄性Sprague- Dawley(SD)大鼠48只随机分为对照组和脊髓损伤组，每组24只。两组依据损伤后取材时间各再分4个亚组。脊髓损伤组应用改良的Allen's重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型，对照组只做T9全椎板切除术。分别于术后6h、1d、3d、7d处死各组大鼠，以损伤部位为中心取材，HE染色观察脊髓组织病理变化，免疫组化染色检测Caspase-1、IL-18的表达情况。结果 对照组大鼠脊髓组织中少量细胞Caspase-1、IL-18表达阳性。脊髓损伤后6h，损伤组Caspase-1、IL-18的表达高于对照组，1d继续增高，3d表达最多，7d略有降低，但仍高于对照组。脊髓损伤组各时间点脊髓组织中Caspase-1和IL-18表达阳性的细胞数较对照组显著增高（P＜0.01）。结论 正常大鼠脊髓组织内存在少量Caspase-1、IL-18的表达。大鼠脊髓损伤后，Caspase-1和IL-18的表达迅速增强。Caspase-1和IL-18的表达增强表明其可能参与了脊髓继发性损伤，并可能是损伤性因素之一。
【关键词】 脊髓损伤；半胱氨酸天冬氨酸酶-1；白细胞介素-18；大鼠
Abstract：Objective To investigate the roles of Caspase-1 and cytokine interleukin -18 activated by Caspase-1 in rats with acute spinal cord injury (SCI). Methods 48 adult Sprague-Dawley(SD) male rats were randomly pided into two groups: The control group (group A) and spinal cord injury group(group B)，each group consisted of 24 rats. According to the time of dissection after SCI， group A and group B were randomly pided into four small groups. The rats of group B used modified Allen's method established model of SCI，the rats of group A just underwent a T9 laminectomy without injury. The rats were sacrificed at 6h， 1d， 3d and 7d respectively after injury， the lesion areas of the spinal cord were dissected for morphological studies by hematoxylin and eosin staining， the expressions of Caspase-1 and Il-18 were detected using immunohistochemistry method. Results The low expressions of Caspase-1 and IL-18 were found in control group. The expressions of Caspase-1 and IL-18 in the spinal cord injury group were higher than those in control group at 6h， it kept increasing at 1d， peaked at 3d，decreased at 7d. The levels of Caspase-1 and IL-18 in the spinal cord injury group were obviously higher than those in the control group at 6h， and at 1， 3， 7days after injury (P＜0.01). Conclusion The low expressions of Caspase-1 and IL-18 can be observed in the non-injury spinal cord. The expressions of Caspase-1 and IL-18 increased quickly after SCI.The increased expressions of Caspase-1 and IL-18 may play important roles in the pathogenesis of SCI.
Key words: spinal cord injury；Caspase-1；interleukin-18；rat
急性脊髓损伤后可引发一系列的病理生理过程，导致继发性损伤。脊髓损伤后神经细胞凋亡［1］及早期诱发的炎症反应可能在继发性损伤中起着重要的作用［2-3］。半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）-1是caspase超家族的重要成员，已有证据表明，Caspase-1及其激活的细胞因子IL-18在中枢神经系统损伤过程中起着重要的作用［4-6］，被认为与机体的炎症反应和细胞凋亡有关。本研究采用改良的Allen’s重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型，免疫组织化学法检测脊髓损伤前后Caspase-1、IL-18的表达变化，探讨其在脊髓继发性损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
成年雄性SD大鼠48只（由宁夏医科大学实验动物中心提供），体重250～320g，随机分为对照组和脊髓损伤组，每组24只，脊髓损伤组应用改良的Allen’s重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型，对照组只做T9全椎板切除术。两组依据损伤后取材时间（分别于术后6h、1d、3d、7d处死各组大鼠）各再分4个亚组，每个亚组6只。
1.2 主要试剂
兔抗大鼠Caspase-1多克隆抗体、兔抗大鼠IL-18多克隆抗体、过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自Tiangen公司。
1.3 脊髓损伤模型制作
大鼠实验前禁食8h，实验顺序随机进行。用30g/L的戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下取腰背部正中切口，逐层分开显露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，显露硬脊膜并使之保持完整，钳夹固定T8及T10棘突，用直径2.5mm、质量10.0g的不锈钢棒沿带有刻度的玻璃导管从25mm高处垂直下落，打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3mm的撞杆上，造成大鼠脊髓不完全损伤，致伤后迅速移开打击物，0号线逐层缝合。模型成功的判定标准：打击后，损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。
术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水5mL，以补充血容量。予青霉素钠盐5万IU背外侧肌群肌注预防感染，每天1次，持续3d。注意保温，分笼饲养，自由取食。每天早8：00及晚8：00行膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性排空。
1.4 取材、切片制备
在相应时间点将大鼠过量麻醉，经左心室-升主动脉插管，快速灌注冰生理盐水(4℃)冲洗，待流出的液体清亮后，灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定45min，自背部原切口显露脊髓，以损伤处为中心，切取长约1.0cm脊髓组织，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液过夜，然后脱水，石蜡包埋（矢状面切成长约3mm的多个节段包埋于同一蜡块中），行矢状面连续切片，每个组织块连续切片10张，片厚4μm。
1.5 HE染色及Caspase-1、IL-18免疫组化染色
每个时间点每只大鼠随机选取2张切片进行HE染色，以损伤严重段脊髓取视野，光镜下观察脊髓组织形态学变化。
每个时间点每只大鼠随机选取4张切片分别进行Caspase-1、IL-18免疫组化染色。免疫组化染色按试剂盒说明书操作，一抗工作浓度分别为1∶300、1∶500，最后用DAB显色，镜下控制，蒸馏水清洗终止显色，苏木素轻度复染，梯度脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。阳性细胞胞浆呈棕黄色。每张切片随机选取6个阳性细胞最多的高倍镜视野（3个灰质和3个白质），计数阳性细胞数，取平均数。
1.6 统计学方法
所有数据以均数±标准差（x±s）形式表示，用SPSS 12.0统计软件处理，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 组织形态学观察结果
脊髓损伤后6h，损伤段脊髓组织中可见大片出血，疏松水肿，灰质结构破坏、细胞空泡变性，部分神经元死亡，存活神经元中部分可见核固缩（图1，见封2）；脊髓损伤后1d，脊髓组织中出血范围扩大，损伤段破坏严重，灰质中神经元大量死亡，部分变性皱缩，白质中可见肿胀的轴突和大量空泡，细胞边界模糊不清，并有白细胞浸润（图2，见封2）；脊髓损伤后3d，损伤中心相邻节段损伤加重，灰、白质中结构破坏明显，部分细胞形态发生改变，可见大量巨噬细胞及少量白细胞浸润（图3，见封2）；脊髓损伤后7d，损伤范围确定，有空洞形成，灰质内残存神经元较少，白质呈脱髓鞘改变，周围有少量淋巴细胞浸润，可见胶质细胞增生（图4，见封2）。
2.2 免疫组化染色结果
2.2.1 Caspase-1的表达
Caspase-1表达阳性的细胞胞浆呈棕黄色颗粒。对照组大鼠脊髓组织中有少量细胞表达阳性。脊髓损伤后损伤及邻近段脊髓组织6h即可见阳性表达的细胞，主要为损伤区灰质神经元；伤后24h阳性细胞明显增多；3d达到高峰（图5、图 6，见封2）；7d时仍较多，主要在损伤邻近段表达。各时间点对照组Caspase-1阳性细胞数少于脊髓损伤组 (P＜0.01)，见表1。表1 两组大鼠不同时间点脊髓组织中Caspase-1的表达变化（略）
2.2.2 IL-18的表达
IL-18表达阳性的细胞胞浆呈棕黄色颗粒。对照组大鼠脊髓组织中有少量细胞表达阳性。脊髓损伤后损伤及邻近段脊髓组织6h即可见阳性表达的细胞，主要为损伤区灰质神经元；伤后24h阳性细胞明显增多；3d达到高峰（图 7、8，见封2）；7d时仍较多，主要在损伤邻近段表达。各时间点对照组IL-18阳性细胞数少于脊髓损伤组(P＜0.01)，见表2。表2 两组大鼠不同时间点脊髓组织中IL-18的表达变化（略）
2.2.3 IL-18和Caspase-1表达关系
二者阳性细胞数间存在显著正相关（r=0.9989， P＜0.01）。
3 讨论
SCI后的继发性损伤是加重神经功能障碍的主要原因，但其具体机制仍未明晰。研究表明，脊髓损伤后神经细胞凋亡［1］及早期诱发的炎症反应可能在继发性损伤中起着重要的作用［2，3］。Hirschberg等［7］还发现SCI后的局部炎症反应不同于周围神经损伤，尽管均有炎症细胞参与，但前者出现炎症细胞的高峰时段较后者延迟，提示SCI引发的炎症反应被特殊的信号分子所启动和调控。迄今，介导SCI后神经细胞凋亡和炎症反应发生发展的确切机制尚未完全清楚。
Caspase-1又称IL-1β转化酶（IL-1βcoverating enzyme， ICE），它不仅以启动者的身份参与了多种细胞的凋亡，更为人所关注的是其对IL-1β和IL-18前体的活化加工作用。Yakoevlev等［8］最早利用大鼠侧方液压脑外伤模型观察到，在大鼠的大脑皮质及海马区Caspase-1的活性和片段化DNA含量均升高，脑室内给予特异性Caspase-1抑制剂IDEVD-fmk治疗，3d后脑组织内DNA分解片段减少，2周后大鼠运动功能明显提高。Chaudhart等［9］发现大鼠视神经损伤后应用Caspase-1抑制剂，可明显减少神经元凋亡的发生。Fink等［10］应用抑制Caspase-1表达的转基因鼠制作脑挫裂伤模型，观察发现小鼠脑挫裂伤损伤面积减少，还发现在伤前应用Caspase-1选择性阻滞剂IVAD-fmk或非选择性阻滞剂Ac-YVAD-fmk， 也可使小鼠脑挫裂伤面积减少。
本实验观察到正常脊髓组织中Caspase-1低水平表达，脊髓损伤后损伤及邻近段脊髓组织中其表达增强，伤后3d达高峰。Caspase-1的表达高峰时相与多数学者关于脊髓损伤后损伤邻近段细胞凋亡的时相分布特点的研究结果吻合［11-12］，提示Caspase-1可能主要参与SCI后的继发性损伤，并导致神经细胞凋亡。
片段化的DNA是细胞凋亡的重要特征。Caspase-1有一种特殊的作用底物多聚二磷酸腺苷核糖体聚合酶（poly ADP-ribosome polymerase）， 此酶被降解后可易化DNA链断裂产生DNA片段［13］。Caspase-1尚可能通过直接裂解一些核内蛋白质如U1-70kD、Lamins(层素)等诱导细胞凋亡［14］。Rabuffetti［15］等的研究还发现，Caspase-1可直接酶解凋亡的最终执行者Caspase-3的前体，使其转变为活性形式引发细胞凋亡；同时它可以与Caspase-3上游激活者Caspase-8相互作用，彼此活化，从而将凋亡信号循环放大［16］。可见，Caspase-1作为一种促凋亡物质，能通过多种机制在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
Wang等［17］发现Caspase-1基因缺陷鼠中没有活性IL-18和IL-1β的合成，提示Caspase-1是IL-18和IL-1β前体活化所必需的。IL-1β和IL-18是两种强有力的致炎细胞因子，均以无活性的前体形式合成，需要经Caspase-1在特定的天冬氨酸残基位点后裂解才能转化为具有生物学功能的成熟分子，而活性的IL-1β和IL-18又通过其种种致炎活性，介导了多种疾病中Caspase-1促损伤作用的发挥［4］。在对新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy， HIE）的研究中发现，Caspase-1主要由脑组织中星型胶质细胞和小胶质细胞表达并分泌，缺血缺氧刺激患儿脑胶质细胞合成分泌Caspase-1增加。HIE病情越重，胶质细胞合成并释放Caspase-1则越多，脑组织中的炎症反应越剧烈［18，19］。脊髓损伤后，局部血管破裂出血、痉挛致脊髓微循环障碍，损伤及邻近段脊髓缺血缺氧，此亦可能增强Caspase-1表达和分泌， 从而发挥促凋亡及活化IL-18致炎促损伤的作用。
Hedtjam等［4］应用双标记免疫荧光测定证实在围产期窒息所致新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后Caspase-1的免疫阳性细胞也都具备IL-18的免疫反应性，反之只有少部分Caspase-1阳性细胞同时表达IL-1β。本实验亦观察到损伤组IL-18的表达增强，各时间点其表达均显著高于对照组，高峰时相亦在第3天， 其表达在时间和空间上与Caspase-1具有紧密的相关性，提示与IL-1β相比，IL-18可能是Caspase-1更佳的作用底物，这与多数学者的研究结果也是一致的［4-5，20］。
IL-18是一种新的复杂多功能的促炎性细胞因子，它能增强Th1细胞和NK细胞表达Fas配体而介导细胞毒作用，通过IL-18受体复合物诱导IL-1、TNF-α的基因表达和合成［21］。低浓度的TNF-α能够诱导细胞凋亡(包括PMN)，而浓度超过一定阈值则可抑制中性粒细胞（polymorphonclear， PMN）凋亡［22-23］。研究表明，中性粒细胞凋亡延缓或障碍与炎症反应的持续及继发组织损伤有关［24］。中性粒细胞凋亡减少，其过度激活，持续释放毒性物质，最终中性粒细胞坏死崩解，释放大量蛋白水解酶类，导致局部组织过度损伤。NF-κB是一类能与多种细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8）基因启动子部位的κB位点结合并增强这些基因转录的蛋白质。IL-18上调NF-κB的表达和活性，并能特异性抑制IL-10的释放，引起炎症级联反应［21］。Wang等［25］证实NF-κB能够激活BCL-2家族中A1/BF1-1，从而阻止细胞色素C从线粒体释放，使Caspase-3失去促发因素，在抗凋亡中发挥作用。后Hinz等［26］还发现NF-κB在基因与蛋白表达水平上控制TRAF1、TRAF2、C-IAP1、C-IAPs， 从而抑制Caspase-8激活，抑制Caspase级联反应。IL-18上调NF-κB的表达和活性，不仅增强炎症因子的表达，同时可能抑制损伤后浸润的中性粒细胞的凋亡，加重局部组织继发性损伤。IL-18还可诱导IL-8、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）、MIP-1(巨噬细胞炎症蛋白-1)和黏附分子ICAM-1、VCAM的表达，吸引、黏附、激活中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞等［21，27］，加重炎症反应并引起内皮细胞损伤，导致毛细血管闭塞、渗漏，间质水肿和微循环障碍，造成组织损害［21］。
本实验选用雄性大鼠的目的是尽量减少内源性雌激素对实验结果的影响。脊髓损伤后Caspase-1及其激活的细胞因子IL-18的表达迅速增强，可能通过致炎促凋亡的双重作用参与了脊髓继发性损伤。对其在继发性脊髓损伤病理生理过程中的作用及其机制进行更加深入的研究和探讨，有可能为SCI后继发性损伤的机制提供更加全面坚实的理论基础，从而开创新的SCI药物治疗途径。
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