作者：丁聃， 王娅娜， 王洁， 王淑静， 张焱， 李宗吉， 赵巍
【摘要】 目的 构建细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组表达质粒ferritin/pET-28a，表达、纯化出重组蛋白，并对重组蛋白的免疫学特性进行初步研究。方法 将目的基因亚克隆至表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG对其进行诱导表达。通过Ni2+的His-bind树脂柱纯化出重组蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，获得抗血清，通过western-blot及ELISA对重组铁蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 表达并纯化出分子量约19kD重组铁蛋白，western-blot显示重组蛋白免疫制备的抗血清可识别纯化的重组蛋白及抗原囊液、原头蚴，位置大致相同，约19kD。ELISA结果显示实验组小鼠与对照组小鼠血清中IgG的OD值有统计学意义(P＜0.01)。结论 细粒棘球蚴重组铁蛋白Eg.ferritin具有较好的抗原性及免疫原性，具有成为包虫疫苗候选分子的潜能。
【关键词】 细粒棘球蚴；重组铁蛋白；纯化；免疫特性
铁蛋白(ferritin)是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，其作用是储存铁，对生物体内铁含量进行调控，在生物体内铁含量过多时起到解毒作用［1-2］，它的存在保证了生命体的正常活动。本实验中心已构建了重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重组蛋白ferritin/GST以包涵体形式存在于细胞中，无法通过亲和层析柱纯化出单一的Eg.ferritin［3］。只能通过切胶纯化的方法获得融合蛋白Ferritin/GST，虽然试验结果说明该融合蛋白具有较好的抗原性及免疫原性，但影响蛋白特性的因素较多，不能很好的反映蛋白的实际特性，因此本次试验将铁蛋白基因重组到表达质粒pET-28a中，pET-28a是个高效表达载体，能纯化变性及非变性的蛋白，通过表达纯化可获得较纯的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，为铁蛋白能成为包虫病候选疫苗提供依据。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表达载体购自Novagen公司。
1.2 试剂 T4连接酶、限制性内切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自Promega公司；β-巯基乙醇、二甲基亚砜、弗氏完全(不完全)佐剂、过硫酸铵、Tween-20等试剂购自于SIGMA公司；考马斯亮蓝购自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物购自OXOID公司；蛋白预染Marker购自北京赛百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚购自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、质粒DNA提取试剂盒等购自北京华美公司；DNA纯化回收试剂盒购自北京赛百盛生物有限公司；标准蛋白分子量Marker 购自中国科学院上海生物化学研究所；含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒购自Novagen公司；其它常用试剂为国产分析纯。
1.3 实验动物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.4 Eg.ferritin/pET-28a重组质粒的构建及鉴定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株划板接菌［4］，并挑单个菌落进行培养，通过碱裂解法提取重组质粒；同时取适量的表达载体pET-28a，将两者分别用BamH I，Not I进行双酶切处理，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离带有双黏性末端的目的片段和表达载体，切胶，经DNA回收试剂盒纯化目的片段及载体。目的片段与表达载体在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜。继而将连接产物转化到已制备好的感受态菌BL21(DE3)plysS中［5］，经含卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB固体培养基筛选阳性菌株［6］。挑取阳性菌株含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，经质粒提取试剂盒纯化重组质粒，用限制性内切酶BamH I，Not I进行酶切鉴定。
1.5 重组铁蛋白的表达、纯化
1.5.1 重组蛋白的表达 将重组菌接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的3mL 的LB培养基中，37℃ 200 r/min 振荡培养数小时，按1∶50接种于50mL培养基中，37℃，220 r/min，培养至OD600=0.5时，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，继续振荡培养6h，4℃ 4000r/min 离心15min，弃上清，收集细菌沉淀，SDS-PAGE观察表达情况。
1.5.2 表达产物的鉴定 将样本与2×SDS-PAGE样本缓冲液混合，经12% SDS-PAGE，180V电压，电泳至溴酚兰指示剂到胶底为止，用0.2%考马斯亮蓝R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脱色液脱色至本底无色。
1.5.3 重组抗原的纯化及制备 对细胞进行裂解，发现重组蛋白以包涵体的形式存在，按照Novagen公司His-bind树脂纯化试剂盒说明书中的包涵体大量纯化方法进行纯化，然后将纯化好的包涵体蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。
1.6 动物免疫及特异性抗血清的制备
1.6.1 动物免疫 ICR小鼠分两组，即免疫组与对照组，每组10只。1)免疫组每只注射弗氏佐剂与重组抗原Eg.ferritin的乳化剂50μg/100μL。对照组注射弗氏佐剂和PBS的乳化剂100μL。根据Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝胶分析系统对纯化的抗原进行定量。2)免疫方法 每组小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基础免疫用弗氏完全佐剂，以后2次为加强免疫均用弗氏不完全佐剂。采用背部皮下多点注射免疫，每次注射量为100μL/只。分别于0、2、4、6周断尾采血，共4次，8周眼眶取血并处死小鼠。
1.6.2 特异性抗血清的制备 将血液4000r/min 离心 10min，提取血清，-20℃保存。
1.7 血清特异性识别 纯化的重组抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原头蚴通过10%分离胶及5%的浓缩胶，180V电压下进行SDS-PAGE电泳 1h。在30mA下对硝酸纤维膜进行印迹转移1h。然后将硝酸纤维膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中，37℃ 封闭1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再将硝酸纤维膜剪开分别浸泡于1∶100稀释的Eg.ferritin免疫的特异性小鼠抗血清及对照组鼠血清中，4℃ 过夜。次日将膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后与1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)结合，37℃反应1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的h3O2)37℃显色5min，最后用蒸馏水冲洗终止反应。
1.8 抗血清中IgG的测定 采用ELISA法，用纯化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶标板100μL/孔，4℃过夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封闭100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫组及对照组小鼠血清作为一抗，按1∶100稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，按1∶1000稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入显色剂100μL/孔，待对照孔显色时，加入2M h3SO4 50μL/孔 终止反应。以包被抗原及进行牛奶封闭的孔为空白调零，置酶标仪450nm波长处测OD值。
1.9 统计学方法 应用SPSS11.0统计学分析软件，采用两样本t检验的方法对测定的OD值进行分析。
2 结果
2.1 表达质粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鉴定
将构建的重组表达质粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性内切酶BamH I和Not I 双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测到插入片断大小约560bp，与目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空质粒；2.Eg·ferritin/
2.2 Eg.ferritin 的纯化
含Ni2+的His-bind树脂亲合柱纯化Eg.ferritin/pET-28a表达的蛋白，经SDS-PAGE，根据标准蛋白分子量可知，纯化蛋白的分子量约19kD.
2.3 特异性抗血清识别纯化蛋白和天然抗原
纯化Eg.ferritin免疫小鼠制备的抗血清可特异性识别未纯化的重组Eg.ferritin，纯化的Eg.ferritin 及天然抗原(原头蚴、囊液)，识别蛋白条带的位置大致相同约19kD(见图3)。
2.4 小鼠血清IgG水平变化
根据对小鼠血清IgG水平在0～8周变化趋势的检测及对免疫组和对照组小鼠血清IgG的比较发现，小鼠血清中IgG的水平随着免疫次数及时间的延长呈上升趋势，免疫4周以后同一时期的免疫组小鼠血清中的IgG水平明显高于对照组(P＜0.01)。表1 两组小鼠免疫不同时间血清IgG水平变化
3 讨论
本实验将细粒棘球蚴铁蛋白基因重新克隆到表达载体pET-28a上，主要考虑：① pET-28a表达载体具有高效表达的能力［7］；② pET28a质粒在插入目的DNA后表达的蛋白N 末端含6个组氨酸，它作为His标签蛋白，可与Ni2+鳌合，使得重组融合蛋白在变性或非变性状态下均可被含Ni2+的His-band 树脂亲合柱纯化，即使被纯化的重组蛋白含量很低也能被有效地纯化出来。克服了本中心已经构建的重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1表达的重组蛋白ferritin/GST不能通过GSTTrapTMFF亲和层析柱纯化的弊端［3］；③重组蛋白是标签蛋白His和目的蛋白共同组成的融合蛋白，为获取目的蛋白，本应通过相应的剪切酶将标签蛋白剪切下来，但由于N-末端组氨酸所表达的蛋白分子量很小，它的存在不改变目的蛋白的活性，所以无须去除。这不仅能减少实验步骤，降低纯化蛋白在酶切过程中的损失，同时还可节省用来购买剪刀酶的费用，为后续研究提供了较好的实验材料。基于此我们得到了一个高效表达且易于纯化重组蛋白的基因工程菌株，并得到了较纯的重组蛋白，进行动物实验。通过实验说明Eg.ferritin作为抗原可诱导动物产生较强的的体液免疫应答，证明其有良好的抗原性；免疫血清与细粒棘球蚴天然抗原(囊液和原头蚴)的Western blot实验结果显示，免疫血清能够较好地识别天然抗原中位于19kD处的条带，说明Eg.ferritin具有较好免疫原性，由此推测中国大陆株细粒棘球蚴铁蛋白基因具有作为包虫疫苗候选分子的潜能，为进行重组铁蛋白对宿主的免疫保护性及保护性机制等方面研究的可能性提供了依据。
参考文献
［1］ Arosio P.Levi S.Ferritin，iron homesostasis，and oxidative damage［J］.Free Radic Biol Med，2002，33(4)：457-463.
［2］ 白霞，周金林，陈天印，等.微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析［J］.畜牧兽医学报，2005，36(1)：66-69.
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［4］ 王娅娜，丁淑琴，王健，等.细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究［J］.中国人兽共患病学报，2006，22(5)：399-402 .
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