作者：杨侃，景丽，安欣，秦憬，郭风英，张建中
【摘要】 目的 观察抗体质量和封闭方法对肾小管免疫组织化学非特异性反应的影响，探讨其控制方法。方法 采用免疫组织化学SP法检测肾脏血管平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA），对比观察不同公司的抗体及不同封闭方法对肾小管非特异性免疫组织化学染色的影响。结果 各组采用正常山羊血清封闭，不同抗体检测结果可见：1号抗体组，肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，且在肾脏皮质区内远曲小管为重；2号抗体组，染色结果与1号抗体基本相同；3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，肾小管上皮细胞内未见着色。各组分别采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后的染色结果可见：1号抗体组，采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后，肾小管上皮细胞染色强度减轻；2号抗体组，在使用不同封闭液的各组间，未见差别；3号抗体组，肾小管上皮细胞内未见着色，其中，25%蛋清+正常山羊血清混合封闭的效果最佳。结论 在免疫组织化学技术中，选择适当的封闭液和抗体是有效控制非特异性染色的重要因素。
【关键词】 免疫组织化学；肾小管；非特异性；平滑肌肌动蛋白
Abstract: Objective To explore the method to suppress the nonspecific immunoreaction of renal tubules. Methods A comparative investigation was carried among the antibodies from different companies and different blocking in the rat kidney by means of Streptavidin-peroxidase technique. Results The results using normal goat serum blocking showed that there were diffuse yellow granullar staining in renal tubule epithelium， and more powerful staining were found in distal convoluted tubule of kidney cortical in No.1 antibody group than that in other groups. The staining profile in the No.2 antibody group was the same as No.1 group. There were yellow staining in vascular smooth muscle cell of kidney， and no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The results using different blocking including normal goat serum，5% BSA，25% egg white， and mixing liquor of normal goat serum with 25%egg white showed that the staining intensity in renal tubule epithelium was lessen used the mixed liquid in the No.1 antibody group. There were no significant difference among the different blocking in the No.2 antibody group. There was no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The best immunostaining was observed in the group with mixed blocking liquid， normal goat serum with 25% egg white. Conclusion It is an important factor for immunohistochemistry to select the blocking liquid and the antibody to suppress the nonspecific reaction.
Key words: immunohistochemistry; kidney; nonspecificity; α-Smooth muscle actin
免疫组织化学技术作为研究蛋白质在细胞原位分布的一种常用方法，具有特异性强、灵敏度高等优点，能够直接进行定性和定量的形态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发生机制等研究提供有力的手段，是一项不可缺少的技术［1］。但由于多种原因，免疫组化染色常出现非特异性染色，甚至干扰正常的染色结果。由于肾小管具有丰富的内源性过氧化物酶、生物素等成分，在免疫组织化学染色中容易出现非特异性染色，严重影响结果的判断［2］。本研究采用免疫组织化学SP法染色，对比观察不同公司的兔抗鼠血管平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA）单克隆抗体及四种封闭方法对肾小管非特异性免疫组织化学染色的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
取正常SD大鼠肾脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度5μm，常规HE染色，观察肾脏组织学结构。SMA单克隆抗体为商品化产品，分别购自博海生物公司、博奥森公司、迈新公司； SP即用型羊抗兔试剂盒购自博奥森公司。其它配套试剂和常规试剂均为通用的商品化产品。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
按照抗体来源分为1、2、3号抗体组；按照封闭方法分为正常山羊血清、5%牛血清白蛋白（BSA）、25%蛋清、正常山羊血清+25%蛋清混合液共4组。
1.2.2 免疫组织学方法
切片脱蜡、水化；柠檬酸盐缓冲液微波修复，自然冷却后，PBS洗涤，3%h3O2室温孵育10min，PBS洗涤，封闭液20min，甩去勿洗，加入SMA单克隆抗体(1∶100)室温孵育2h，PBS洗涤，生物素化二抗室温孵育20min，PBS洗涤，辣根酶标记的链酶卵白素室温孵育30min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。以正常山羊血清封闭作为常规封闭方法，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.3 结果判断
在显微镜下观察切片染色情况，阳性结果为淡黄色到棕褐色，定位于平滑肌细胞质，以血管平滑肌细胞阳性、肾小管阴性作为染色成功的标准；平滑肌细胞不着色为染色失败的标准；具有肾小管染色者为非特异染色的标准。根据染色结果，对不同公司来源的抗体和不同封闭方法的染色结果进行评价。
2 结果
2.1 肾脏组织学观察
肾脏结构清晰，肾小球分布正常，主要集中在肾脏皮质，肾小球大小均匀，毛细血管结构清楚，无系膜细胞和内皮细胞的增生。近曲小管、远曲小管和集合小管分布正常，上皮细胞结构清晰，无细胞变性和坏死，肾小管腔无蛋白管型以及蛋白性物质。肾脏间质和肾盂正常，无明显充血和水肿及炎症反应。入球动脉和出球动脉清晰可见，具有1-2层平滑肌细胞，可见内皮细胞，无血管壁的玻璃样变性。小叶间动脉、弓状动脉和叶间动脉分布正常，管壁平滑肌细胞清晰可见，未见血管壁增厚以及血管炎症反应。
2.2 不同来源抗体染色结果
均采用正常山羊血清封闭，免疫组织化学染色结果可见，1号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内可见黄色细颗粒状着色，同时，在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，且在肾脏皮质区内远曲小管为重（图1A，见封3）；2号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内均可见呈弥漫分布的棕黄色着色，在肾小管上皮细胞内也可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，并以远曲小管上皮细胞为重（图1B，见封3）；3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，使各级血管轮廓清晰可见，肾小管上皮细胞内未见着色，背景基本干净（图1C，见封3）。
2.3 不同封闭方法染色结果
分别采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后的免疫组织化学染色结果可见，1号抗体组在5%BSA、25%蛋清液封闭后，肾脏血管平滑肌细胞内可见局灶性细颗粒状黄色着色，着色均比较浅淡，使血管轮廓不清晰，而在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，尤其是远曲小管着色最重。采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后，肾小管上皮细胞染色强度减轻，表现为浅黄色细颗粒状着色（图2A，见封3）；2号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内均可见呈弥漫分布的颗粒状棕黄色着色，同时在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，在使用不同封闭液的各组间无明显差异（图2B，见封3）。3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，各级血管轮廓清晰可见，肾小管上皮细胞内未见着色，背景干净，其中，25%蛋清+山羊血清混合封闭的效果最佳（图2C，见封3）。
3 讨论
免疫组织化学是在蛋白质水平上定位观察的一种常用技术，应用范围非常广泛［1－2］。但是，免疫组化又是多步骤、多因素决定其结果的方法，存在很多干扰因素，甚至会导致结果的误判和误诊。影响免疫组化结果的诸多内外因素中，富含内源性过氧化物酶、内源性生物素的组织，以及一抗的质量问题是引起非特异染色、影响免疫组化结果的常见原因。
在代谢旺盛的含有丰富线粒体细胞的组织中，如肾脏、肝脏、甲状腺等，其所含的内源性生物素蛋白结合物广泛存在于细胞质中，着色后出现足以以假乱真的阳性结果，引起误判，有时会严重影响结果的正确判断。本研究结果也发现肾小管的非特异染色，通过采用25%蛋清+正常山羊血清混合封闭能够明显减少肾小管非特异性免疫组织化学染色，这与以往的研究报道基本一致［1］。
在本实验中我们发现，除上述因素外，在免疫组化技术中，抗体的敏感性、特异性及检测系统的选择和应用也是控制非特异性染色的重要因素，与有关研究一致［3］。抗体的特异性是指一种抗体只能结合某一种组织上刺激该抗体产生的特定抗原表位而引起免疫反应。事实上，任何组织的免疫表型都非常复杂，因此组织中相似的抗原表位，即共同表位与抗体的交叉反应也是混淆免疫组化结果的重要原因，所以在抗原抗体反应中，抗体的特异性就显得特别的重要。此外，在选择适宜的抗体时，也应考虑到其敏感性。一般而言，单克隆抗体的特异性较多克隆抗体高，但多克隆抗体的敏感性比单克隆抗体高，所以，要想得到满意的染色结果，应该综合考虑到抗体的特性。本实验可以看到，使用3号抗体的各组中，选择不同的封闭液进行封闭，血管平滑肌细胞均出现特异性染色，而肾小管上皮细胞未见非特异性着色。而在使用1和2号抗体的各实验组中，尽管使用了各种不同的封闭方法对其非特异性进行控制，但是效果不佳，肾小管上皮细胞均仍然出现非特异染色。提示选择优质抗体也是有效防止肾小管免疫组化非特异染色，保证免疫组化质量的重要因素。
参考文献
［1］Miller RT，Kubier P. Blocking of endogenous activity in immunohistochemistry:The use of egg whites［J］.Applied Immunohistochemistry，1997，5 (1):63-66.
［2］王永军，黄瑾，杨会钗，等.免疫组织化学染色中消除内源性生物素的方法研究［J］.河北医科大学学报，2008，29(3):453.
［3］周晓军.免疫组化在病理诊断中的正确应用［J］.诊断病理学杂志，2003，10:232-235.