抑癌p53基因在星形细胞瘤中阳性表达的意义

　　　　 作者：薛建荣，秦坤明，陈家康，陆建吾，文超勇

【摘要】 　　目的 研究p53在星形细胞瘤发生、增殖过程中的作用及临床意义。方法 采用免疫组织化学法(SP法)检测62例资料完整的星形细胞瘤及10例正常脑组织的p53表达，分析p53蛋白在星形细胞瘤及正常脑组织中的表达情况。结果 正常脑组织中未见p53蛋白阳性表达，62例星形细胞瘤中共有26例肿瘤p53蛋白表达呈阳性，二者差异有显著性（χ2=4.872，P＜0.05），其中在Ⅰ级星形细胞瘤中阳性率为8.33%(1/12)，Ⅱ级星形细胞瘤中阳性率为21.05%(4/19)，Ⅲ级间变性星形细胞瘤中阳性率为 60%(9/15)，Ⅳ级胶质母细胞瘤中阳性率为75%(12/16)。结论 星形细胞瘤中p53蛋白的表达与肿瘤的级别相关，分化程度越低，p53蛋白阳性表达率越高，检测p53有助于临床判断预后。

【关键词】 星形细胞瘤 抑癌p53基因 免疫组织化学

　　【Abstract】 Objective To investigate the role of p53 during the proccess of the astrocytoma occurrence and cell proliferation，so as the clinical significance.Methods The positive expression of p53 protein were detected in the specimens of 62 cases of astrocytoma by SP immunological technique，aside with 10 cases of normal brain tissue. Then the expression of p53 protein in these tissues were analysed.Results There were 26 cases positive expression of p53 protein in 62 astrocytoma specimens and no positive expression of p53 protein in the normal brain tissue. It showed a significant persity between the two groups(χ2=4.872，P＜0.05). The positive percentage was 8.33%(1/12) in grade I astrocytomas，21.05%(4/19) in grade II astrocytomas，60%(9/15) in grade III anaplastic astrocytomas(AA) and 75%(12/16) in grade IV glioblastoma multiforme(GBM).Conclusion The results reveal a correlation between p53 protein expression and histopathological typing and grading in astrocytomas. The degree of cell differentiation is lower， the ratio and intensity of p53 expression is obviously higher， which can help to evalue prognosis.
　　
　　【Key words】 astrocytoma；antioncogene p53；immunohistochemistry
　　
　　星形细胞肿瘤是颅内最常见的肿瘤，约占胶质瘤21.2﹪～51.6﹪，因生长迅速，侵袭性强，与正常脑组织分界不清，治疗棘手，易复发。近年来，随着研究的深入，人们认识到作为重要的抑癌基因之一的p53基因若发生突变，其基因编码的突变p53蛋白具有促进细胞无序增殖，演变成肿瘤，并且灭活正常的p53蛋白。本实验采用免疫组织化学染色技术，检测p53蛋白在星形细胞瘤中的表达。

　　资料和方法　　

　　1.临床资料 收集广西医科大学第一附属医院2004～2005年临床和病理资料完整的星形细胞瘤62例，其中男39例，女23例，年龄16～81岁，平均39±13.72岁。肿瘤部位：额叶18例，颞叶13例，顶叶9例，枕叶5例，颞顶叶7例，小脑5例，脑干1例，脊髓4例。所有病例术前均未经放疗和化疗，所收集标本均经石蜡包埋处理，每例石蜡标本病理结果由两名富有经验的神经病理学专家确诊，分级依据WHO2000年中枢神经系统肿瘤分类标准，包括Ⅰ级星形细胞瘤12 例、Ⅱ级星形细胞瘤19 例，Ⅲ级间变性星形细胞瘤15 例，Ⅳ级胶质母细胞瘤16 例。另收集10例因重型颅脑损伤而行颅内减压手术切除的正常脑组织制成石蜡标本作为阴性对照。所有标本均制成厚4 μm连续组织切片，置于已经过胶(APES)的清洁载玻片上。
　　
　　2.方法 采用免疫组化染色法（SP法），所有试剂均购自福建迈新生物技术有限公司。切片经烤片，脱蜡，梯度酒精水化，3％h3O2灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，微波抗原修复，10%正常山羊血清封闭，湿盒内孵育在同一组织蜡块所切的组织切片分别加入p53单克隆抗体，PBS代替一抗作为空白对照， PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗工作液（抗小鼠），均置于湿盒内，37℃孵育30分钟，滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶（辣根过氧化物酶）；DAB显色剂显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水中反蓝；封片后显微镜观察结果。采用试剂公司提供的阳性组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。正常脑组织标本切片作为阴性对照。
　　
　　3.结果判定 细胞内出现棕黄色颗粒即定为阳性，无棕黄色颗粒为阴性。每张切片选取具有代表性的肿瘤区域在高倍镜下（×400）随机选择5个以上视野，计数1000个肿瘤细胞，计阳性细胞百分率，坏死区和血管内皮细胞不被计算在内。
　　
　　4.统计学处理 根据实验资料的性质，对于所得数据采用SPSS for Windows 13.0统计软件进行χ2 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　结果　　

　　1.p53在星形细胞瘤和正常脑组织中的表达情况 p53在星形细胞瘤和正常脑组织的表达率分别为41.94%和0%，经卡方检验，二者差异有显著性意义（χ2=4.872，P＜0.05），见表1。p53在星形细胞中的阳性表达见图1。

　　表1 p53在星形细胞瘤和正常脑组织的表达（略）

　　注：χ2=4.872，※P＜0.05

　　图1 p53在星形细胞瘤中的阳性表达（×400）（略）
　　
　　2.p53在各级别星形细胞瘤中的表达情况 星形细胞瘤级别不同，p53蛋白阳性表达情况不同，差异有显著性意义（χ2=18.161，P＜0.01）。随着星形细胞瘤级别的提高，阳性表达率增高，见表2。

　　表2 星形细胞瘤中p53蛋白的阳性表达情况（略）

　　注：各级阳性率比较，※χ2=18.161，P＜0.01

　　讨论

　　现代分子生物学理论认为，肿瘤的发生主要是由于原癌基因的激活或抑癌基因的失活，造成细胞增殖周期的失控而形成。p53基因是抑癌基因的一种，定位于人17号染色体短臂上(17p13.1)，有11个外显子和10个内含子，起着防止肿瘤发生的作用，主要生物学功能是对细胞增殖、凋亡、分化起负性调控作用，通过独立和非独立机制确保细胞进入有效的死亡程序过程，其他p53基因家族成员也能够促进肿瘤细胞的程序性凋亡，这一作用与p53基因并行或协调［1］。p53可由于多种细胞应激而激活，包括DNA损伤、组织缺氧和促有丝分裂的肿瘤基因。p53基因应对细胞过多增殖而激活，其肿瘤抑制活力来源于消除存在肿瘤基因表达的细胞［2］。
　　
　　在各种致癌因子作用下，p53基因发生突变后，失去野生型的各种生物功能，不能保持基因的稳定性，不能够发挥程序性凋亡作用，从而促进肿瘤的发生和抗药性［3］。当发生p53基因突变和杂合、丢失、重排而失活时，常引起肿瘤的发生和发展［4］。GilPerotin等研究室管膜下区胶质瘤发现p53缺失提供了该区细胞群全速或快速增殖的优势，这与迅速出现的变异相关，细胞数量和密度增加，当缺乏p53的诱变刺激时，导致细胞自我更新及分化功能受损的变化，这可能是成人室管膜下区慢增殖细胞产生胶质瘤的机制［5］。正常脑发育过程中神经胶原控制途径异常，如神经干细胞分化成星形细胞的过程，可能导致多型性胶质母细胞瘤形成，这些途径包括生长因子介导的信号转导途径和细胞周期进程的控制过程，例如p16CDK4RB和ARFMDM2p53途径［6］。p53基因突变后其编码的蛋白构象也发生了改变，半衰期延长，在细胞中稳定性增加。由于其半衰期延长能够被免疫组化法检测出来，因而可作为p53基因突变的间接指标。
　　
　　本实验显示p53蛋白阳性表达主要位于细胞核，免疫组织化学呈棕黄色染色。p53蛋白阳性细胞呈局灶性、分散性不均匀分布。正常脑组织中无p53蛋白阳性表达，而星形细胞瘤中p53蛋白阳性表达率为41.94%，二者之间的差异有显著性（χ2=4.872，P＜0.05），这进一步证实了p53在星形细胞瘤的发生中起重要作用。随着肿瘤分级的增高，p53蛋白阳性细胞数表达率也增高(χ2=18.161，P＜0.01)，这表明突变型的p53基因的存在与星形细胞瘤的恶性程度有关。Ganigi等回顾性分析54例年龄从9岁到15岁的部位不同的儿童多型性胶质母细胞瘤，发现p53在53.7%病例中免疫组化反应阳性，其中主要是位于丘脑(75%)和大脑半球(62.2%)的多型性胶质母细胞瘤，其次是位于脑干的肿瘤 (30%)，而在小脑肿瘤不表达p53蛋白。与p53阴性表达的肿瘤相比，p53阳性的的肿瘤具有高的MIB1（Ki67） LI (P=0.003。p53 和bcl2阳性表达的病人预后差，并且p53在幕上肿瘤表达更多，认为p53和bcl2阳性表达与不良预后相关［7］。本实验中p53蛋白在多型性胶质母细胞瘤中的表达率比Ganigi的结果略高，可能是因为选取病例的年龄段不同，肿瘤部位不同的原因也不能排除，本实验的病例年龄跨度大，多位于幕上。Deb等认为多型性胶质母细胞瘤生存期（中位数）为10～12月，超过3年到5年的很少，他研究6例平均生存时间达9年（范围5～15年）多型性胶质母细胞瘤，发现其中的5个病例中有4个p53蛋白免疫表达呈阳性，MIB1LI平均为12% (范围6%～20%)，认为对于有少突胶质细胞和（或者）巨细胞组成的年轻的病人，包括有增殖指数和p53表达的，应该谨慎的评价预后，这部分病人可能有预后的不确定性［8］。可见，p53 对于星形细胞瘤的肿瘤分级有一定的帮助，可作为判断星形细胞瘤恶性程度及预后的指标。

参考文献

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　　［6］Hulleman E，Helin K.Molecular mechanisms in gliomagenesis［J］.Adv Cancer Res， 2005， 94: 1-27.

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　　［8］Deb P，Sjarma MC，Mahapatra AK，et al.Glioblastoma multiforme with long term survival［J］.Neurol India， 2005，53(3):329-332.