【摘要】 目的：探讨亚低温对大鼠急性局灶性脑缺血后脑组织内热休克蛋白70(Hsp70)表达的影响及意义。方法：将48只SD大鼠随机分为亚低温组及对照组，各组再分为3个亚组，每亚组8只，参照改良的Longa栓线法构建大鼠局灶性脑缺血模型，亚低温组大鼠给予亚低温治疗2小时，而对照组不作亚低温处理。分别于缺血后12小时、24小时、48小时将大鼠处死，用免疫细胞化学技术检测半暗带Hsp70蛋白表达，进行半定量分析。结果：热休克蛋白表达计数同一亚组比较亚低温组明显少于常温组，在24小时亚组和48小时亚组差异有统计学意义(P&<0.05)。结论：亚低温减少了缺血半暗带，使大鼠急性局灶性脑缺血后脑组织内Hsp70表达减少，具有脑保护作用。
【关键词】 亚低温;脑缺血;热休克蛋白70
Abstract Objective: To investigate the effectiveness of mild hypothermia therapy on heat shock protein(Hsp) expression in rats with focal cerebral ischemia. Methods: 48 SD rats were randomly pided into the trial group(the mild hypothermia group) and the control group. Each group was subpided into 3 groups (sub-groups) according to the post-infarction disposal time， with 8 SD rats in each sub-group. The rat models of focal cerebral ischemia were established with the modified Longa method. The rats in the trial group were cooled by mild hypothermia for two hours， while those in the control group were subjected to no disposal. The rats in every sub-group was killed at the points of 12 hours， 24 hours， 48 hours after infarction， respectively. Immunohistochemistry method was performed to confirm the expression of the Hsp 70 at the"penumbra field"in rat brain tissue. Results: The expression of the Hsp70 in rats of the trial group was less than that of the control groups at each time point ， there was significant difference in the expression of Hsp70 between the 24 hours subgroup and the 48 hours subgroup (P&<0.05).Conclusion: mild hypothermia therapy decreases the peripheral penumbra size of cerebral infarction tissues and the expression of Hsp70 in rats with focal cerebral ischemia and possesses protective effect on ischemic brain.
Key words Mild hypothermia; Brain ischemia; Heat shock protein 70
低温一般分为轻度低温(mild hypothermia)(33～35℃)；中度低温(moderate hypothermia)(28～32℃);深度低温(profound hypothermia)(17～27℃);超深低温(ultraprofound hypothermia)(2～16℃)。亚低温一般指32～35℃的低温，亚低温脑保护的研究已有数十年历史，脑组织热休克蛋白70 (Heat-shock protein 70，Hsp70)主要存在于缺血半暗带，本研究通过观察亚低温处理后实验大鼠缺血区脑组织内Hsp70含量的变化，探讨亚低温的脑保护机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康SD大鼠雌雄不计共48只，体重300～330g，随机分为两组：亚低温组和常温组，每组在术后又分为12小时、24小时、48小时3个亚组。
1.2 脑缺血模型的制备 参照改良的Longa栓线法[1]构建大鼠局灶性脑缺血模型，用2%戊巴比妥钠按45mg/kg体重腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定于手术台，亚低温组头枕冰帽，测颞肌温度，待颞肌温度低于35℃时开始手术，并将温度控制在32～35℃之间2小时，常温组麻醉成功后即可手术。
1.3 选入标准 （1）提尾后右前肢内收屈曲，（2）爬行时向右侧划圈（“追尾现象”），（3）站立时向右侧倾倒。凡具有上述体征之一者可入选本实验。
1.4 免疫组化 将脑缺血12小时、24小时、48小时后每组动物各8只，常规灌流，具体做法为在规定的时间点以过量的10%水合氯醛再次麻醉大鼠后，迅速暴露心脏，向左心室内插管，同时剪开右心耳，先向左心室中迅速灌入0.9%氯化钠溶液约250mL，当大鼠右心耳流出的液体变为无色时再向左心室内灌入新配制的4%多聚甲醛磷酸缓冲液250mL，等待大鼠肢体僵硬后迅速断头取脑， 标本入-20℃冰箱冷冻15分钟后做连续冠状切片，片厚2mm，共6片，留取第4片(B-2.2至B-4.2区)入4%多聚甲醛后固定以作冰冻切片之用，其余厚片用于TTC染色，第4片后固定后在恒低温切片机上制成片厚30μm的冰冻切片，用于免疫组化和HE染色。
1.5 TTC染色 将脑组织置于-20℃下冷冻20分钟，放入10%TTC溶液(2，3，5- Triphyltetrazolium)，避光，37℃恒温水浴箱孵育30分钟，继以4%多聚甲醛缓冲液后固定3～5天，非梗死区呈红色，梗死区不着色。
1.6 HE染色 用10%甲醛溶液固定24小时以上，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察脑组织病理改变。
1.7 热休克蛋白70测定 第4片后固定后在恒低温切片机上制成片厚30μm的冰冻切片制成石蜡块，用石蜡切片机切成 20μm切片，捞片后置于烤箱，58～60℃烤30分钟后取出；加枸橼酸缓冲液中置于微波炉加热至沸腾，间隔10分钟反复2～3次，自然冷却；血清封闭10分钟，滴加小鼠Hsp70抗体(4℃)过夜；滴加1∶100生物素化山羊抗小鼠IgG(37℃)，孵化30分钟；滴加SABC复合物(37℃)，孵育30分钟，DAB显色，酒精梯度脱水、透明、封片。光镜下观察染色结果，并按照McCarthy等的方法对免疫组化染色结果进行半定量分析。即按照细胞着色的程度分为0、1、2、3四级，分别对应无着色、轻度着色、明显着色和深度着色，每张切片计数100个相邻细胞，计算出4种着色程度细胞的百分数，最终抗原表达程度的分值按公式ΣPi×I计算，其中I为细胞着色程度，取值为0、1、2、3，Pi为细胞着色为I时的细胞百分数。
1.8 观察指标
1.8.1 神经功能缺损评分 参见Longa等[1]5分制评分标准：0分，无神经功能障碍；1分，轻度神经功能缺损（前爪不能完全伸展）；2分，中度神经功能缺损（向患侧转圈）；3分，严重神经功能缺损（向患侧倾斜）；4分，昏迷、意识不清。3个亚组中大鼠神经功能评分处死时较选入时减少1分或1分以上为好转，未减少或增加评为未愈。
1.8.2 脑梗死体积计算 经TTC染色的脑组织厚片，采用计算机图形分析系统进行梗死面积测定，按公式:梗死体积=(各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和)/2×每片厚度，换算成体积。为排除脑水肿因素干扰，以正常大鼠大脑体积为基准换算出梗死灶体积占大脑(不包括嗅球)体积的百分比进行统计分析，以梗死体积/正常大鼠大脑体积×100%表示。
1.8.3 病理学检查 光镜观察：尼氏染色和HE染色后，由大脑正中裂旁开1cm开始，用目镜网格测试系统在40×10放大倍数下进行半定量分析，连续记数3个视野顶叶皮层第三层神经元总数及变性、坏死神经元所占百分数及40倍下扩张的微血管数。
1.8.4 热休克蛋白70测定 采用病理图像分析仪随机选10个高倍镜(×400)非重叠视野记录阳性细胞数，求均值。
1.9 统计学方法 采用常规统计学方法t检验分析实验结果。
2 结果
实验用48只SD大鼠成功栓塞42只(87.5%)，剩余6只中2只麻醉剂过量当时死亡，4只于手术过程中死亡。亚低温组12小时、24小时、48小时各亚组神经功能评分好转例数分别为4例、5例、7例，好转率分别为66.7%(4/6)、83.3%(5/6)、87.5%(7/8)，常温组12小时、24小时、48小时各亚组神经功能评分好转例数分别为4例、4例、4例，好转率分别为50%(4/8)、57.1%(4/7)、57.1%(4/7)。病理切片HE染色可见神经元变性坏死，大量神经元胞核固缩，尼氏体消失，并可见到神经元周围空泡样改变，镜下有时还可见到大脑中动脉的内皮受损表现。但上述表现亚低温组较常温组轻，见图1、图2。脑梗死体积测定见表1，各亚组比较，24小时组及48小时组亚低温组较常温组差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。热休克蛋白免疫组化测定发现大鼠不同脑区神经元和胞质均可见HSP70的表达，见图3、图4。亚低温及常温组大鼠相应脑区HSP70阳性神经元的数目见表2， 24小时组及48小时组亚低温组较常温组差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。表1 各亚组脑梗死体积比值表2 各亚组HSP70 计数
3 讨论
脑组织对缺血、缺氧损害非常敏感，阻断血流30秒钟脑代谢即发生改变，1分钟后神经元功能活动停止，脑动脉闭塞导致缺血超过5分钟可发生脑梗死，急性脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成，坏死区由于完全性缺血导致脑细胞死亡，但缺血半暗带仍存在侧支循环，可获得部分血液供应，尚有大量可存活的神经元，如果血流迅速恢复使脑代谢改善，损伤仍旧为可逆性，神经元细胞仍可存活并恢复功能，保护这些可逆性损伤神经元是急性脑梗死治疗的关键[2]。
上世纪80年代，人们发现如果脑温低于正常值的2～6℃（即亚低温），能够对缺血脑组织起到明显的保护作用，而且没有严重的并发症[3]。Reith[4]证实，亚低温能够降低死亡率改善病人的预后。亚低温的脑保护机制主要有：（1）降低脑代谢率，减少ATP的消耗，减少耗氧量，促进脑组织ATP含量、磷酸肌酸浓度以及细胞内pH的恢复[5]。（2）低温减低兴奋性氨基酸的释放，减少钙离子内流，抑制炎症反应的发生。（3）低温能降低颅内压、减轻脑水肿[6]。（4）亚低温能抑制神经元的凋亡。（5）亚低温可调节损伤后钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的活性。
热休克蛋白是一种病理性应激蛋白，人体在某些环境因素及应激刺激，如缺血、缺氧、病毒感染、重金属离子、DNA损伤，特别是热的作用后，发生热休克反应，一些正常蛋白质的合成受到抑制，同时发生热休克蛋白基因的表达或表达增加。正常脑组织Hsp70 mRNA及Hsp70蛋白含量很少，局灶及全脑缺血后受损细胞内的变性蛋白质诱导Hsp70的表达。Hsp70还可以增强组织细胞对应激刺激的耐受性。持续性MCAO后Hsp70的表达主要见于缺血后的半暗带(penumbra)，即蛋白质合成受抑制而ATP保存的区域，于血管闭塞后3小时达高峰。缺血后Hsp70的诱导，见于对缺血最敏感的神经元，出现于缺血损伤后存活神经元中。影响Hsp表达的因素主要是局部脑血流量的改变。大鼠非致死性脑缺血后，在MCA供血区呈现高度Hsp70的表达。Nowak等[7]发现，Hsp72的表达主要局限于脑血流量低于对照水平50%的区域，所供给的残余血量能够诱导mRNA及蛋白质的合成。局灶脑缺血后Hsp72的诱导，见于少数存活的细胞群，即那些代谢遭损害但损伤为可逆性的细胞。脑梗死后机体处于一种应激状态，能够诱导Hsp的产生。Hsp主要发挥分子伴侣的作用，能与蛋白分子结合，保护新合成的蛋白质分子的正确构型，防止在正确的多聚体形成以前蛋白亚单位发生错误的折叠和聚焦，在经历持续性亚致死性缺血损伤的局灶性脑缺血，Hsp70的表达见于严重缺血的边缘区域，Hsp70可以作为缺血性半暗带的生物学标志。
脑缺血后发生应激反应的标志之一是Hsp蛋白的诱导表达。亚低温时Hsp表达的多寡，可能主要取决于缺血后半暗带的大小。本实验结果显示亚低温治疗减少了脑梗死的体积，但Hsp70的表达是减少的，这与缺乏缺血后再灌注有关。但它反映了亚低温治疗后缺血半暗带较常温组减小，具有脑保护作用。王强等[8-9]实验认为，亚低温治疗后脑组织Hsp70 mRNA表达增多，即刻后亚低温作用优于缺血后再灌注。Suga等[10] 研究了沙土鼠短暂缺血后脑温对Hsp72表达的影响，显示Hsp72的诱导显著依赖于缺血后的脑部高温。缺血后脑温对脑损伤的程度有很大影响，再灌注期间脑温的高低也影响脑损伤的程度。脑温的变化改变了脑缺血后的基因表达，并可能诱导脑组织对缺血损伤的耐受性。
参考文献
[1] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84-91.
[2] 王维治，罗祖明.神经病学[M].5版.北京:人民卫生出版社，2004:135.
[3] 曹绪政，苏志强，徐建民，等.局部亚低温对脑梗死大鼠的脑保护作用[J].中国临床康复，2005，9(13):208-209.
[4] 陈红，钱坤，李承晏，等.低温对脑梗死灶周边葡萄糖利用率的影响[J].武汉大学学报，2004，25(2):126-128.
[5] Reith J，Jorgensen HS，Pedersen PM，et al.Body temperature in acute stroke：relation to stroke severity，infarct size，mortality，and outcome[J].Lancet，1996，347(8999):422-425.
[6] 陆杨春，周大勇.头部亚低温治疗急性脑水肿58例临床观察[J].右江民族医学院学报，2006，28(4):553.
[7] Nowak TS Jr，Jacewicz M.The heat shock/stress response in focaol cerebral ischemia[J].Brain Pathol，1994，4(1):67-76.
[8] 王强，孙毅明，李铁山，等.亚低温对大鼠局灶性缺血后HSP70 mRNA表达的影响[J].青岛大学医学院学报，2005，41(2):146-148.
[9] 王强，孙毅明，李铁山，等.亚低温对大鼠局灶性缺血后神经凋亡及Bcl-Xl、Bcl-Xs、HSP70 mRNA表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2005，27(5):272-275.
[10] Suga S，Nowak TS Jr.Postischemic hyperthermia increases expression of Hsp72 mRNA after brief ischemia in the gerbil[J].Neurosci Lett，1998，243(1-3):57-60.
2 结果
实验用48只SD大鼠成功栓塞42只(87.5%)，剩余6只中2只麻醉剂过量当时死亡，4只于手术过程中死亡。亚低温组12小时、24小时、48小时各亚组神经功能评分好转例数分别为4例、5例、7例，好转率分别为66.7%(4/6)、83.3%(5/6)、87.5%(7/8)，常温组12小时、24小时、48小时各亚组神经功能评分好转例数分别为4例、4例、4例，好转率分别为50%(4/8)、57.1%(4/7)、57.1%(4/7)。病理切片HE染色可见神经元变性坏死，大量神经元胞核固缩，尼氏体消失，并可见到神经元周围空泡样改变，镜下有时还可见到大脑中动脉的内皮受损表现。但上述表现亚低温组较常温组轻，见图1、图2。脑梗死体积测定见表1，各亚组比较，24小时组及48小时组亚低温组较常温组差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。热休克蛋白免疫组化测定发现大鼠不同脑区神经元和胞质均可见HSP70的表达，见图3、图4。亚低温及常温组大鼠相应脑区HSP70阳性神经元的数目见表2， 24小时组及48小时组亚低温组较常温组差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。表1 各亚组脑梗死体积比值表2 各亚组HSP70 计数
3 讨论
脑组织对缺血、缺氧损害非常敏感，阻断血流30秒钟脑代谢即发生改变，1分钟后神经元功能活动停止，脑动脉闭塞导致缺血超过5分钟可发生脑梗死，急性脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成，坏死区由于完全性缺血导致脑细胞死亡，但缺血半暗带仍存在侧支循环，可获得部分血液供应，尚有大量可存活的神经元，如果血流迅速恢复使脑代谢改善，损伤仍旧为可逆性，神经元细胞仍可存活并恢复功能，保护这些可逆性损伤神经元是急性脑梗死治疗的关键[2]。
上世纪80年代，人们发现如果脑温低于正常值的2～6℃（即亚低温），能够对缺血脑组织起到明显的保护作用，而且没有严重的并发症[3]。Reith[4]证实，亚低温能够降低死亡率改善病人的预后。亚低温的脑保护机制主要有：（1）降低脑代谢率，减少ATP的消耗，减少耗氧量，促进脑组织ATP含量、磷酸肌酸浓度以及细胞内pH的恢复[5]。（2）低温减低兴奋性氨基酸的释放，减少钙离子内流，抑制炎症反应的发生。（3）低温能降低颅内压、减轻脑水肿[6]。（4）亚低温能抑制神经元的凋亡。（5）亚低温可调节损伤后钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的活性。
热休克蛋白是一种病理性应激蛋白，人体在某些环境因素及应激刺激，如缺血、缺氧、病毒感染、重金属离子、DNA损伤，特别是热的作用后，发生热休克反应，一些正常蛋白质的合成受到抑制，同时发生热休克蛋白基因的表达或表达增加。正常脑组织Hsp70 mRNA及Hsp70蛋白含量很少，局灶及全脑缺血后受损细胞内的变性蛋白质诱导Hsp70的表达。Hsp70还可以增强组织细胞对应激刺激的耐受性。持续性MCAO后Hsp70的表达主要见于缺血后的半暗带(penumbra)，即蛋白质合成受抑制而ATP保存的区域，于血管闭塞后3小时达高峰。缺血后Hsp70的诱导，见于对缺血最敏感的神经元，出现于缺血损伤后存活神经元中。影响Hsp表达的因素主要是局部脑血流量的改变。大鼠非致死性脑缺血后，在MCA供血区呈现高度Hsp70的表达。Nowak等[7]发现，Hsp72的表达主要局限于脑血流量低于对照水平50%的区域，所供给的残余血量能够诱导mRNA及蛋白质的合成。局灶脑缺血后Hsp72的诱导，见于少数存活的细胞群，即那些代谢遭损害但损伤为可逆性的细胞。脑梗死后机体处于一种应激状态，能够诱导Hsp的产生。Hsp主要发挥分子伴侣的作用，能与蛋白分子结合，保护新合成的蛋白质分子的正确构型，防止在正确的多聚体形成以前蛋白亚单位发生错误的折叠和聚焦，在经历持续性亚致死性缺血损伤的局灶性脑缺血，Hsp70的表达见于严重缺血的边缘区域，Hsp70可以作为缺血性半暗带的生物学标志。
脑缺血后发生应激反应的标志之一是Hsp蛋白的诱导表达。亚低温时Hsp表达的多寡，可能主要取决于缺血后半暗带的大小。本实验结果显示亚低温治疗减少了脑梗死的体积，但Hsp70的表达是减少的，这与缺乏缺血后再灌注有关。但它反映了亚低温治疗后缺血半暗带较常温组减小，具有脑保护作用。王强等[8-9]实验认为，亚低温治疗后脑组织Hsp70 mRNA表达增多，即刻后亚低温作用优于缺血后再灌注。Suga等[10] 研究了沙土鼠短暂缺血后脑温对Hsp72表达的影响，显示Hsp72的诱导显著依赖于缺血后的脑部高温。缺血后脑温对脑损伤的程度有很大影响，再灌注期间脑温的高低也影响脑损伤的程度。脑温的变化改变了脑缺血后的基因表达，并可能诱导脑组织对缺血损伤的耐受性。
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[9] 王强，孙毅明，李铁山，等.亚低温对大鼠局灶性缺血后神经凋亡及Bcl-Xl、Bcl-Xs、HSP70 mRNA表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2005，27(5):272-275.
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