【摘要】 目的 探讨CD44V6、HIF-1α、VEGF在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达与非小细胞肺癌侵袭和转移的关系。方法 通过免疫组化的方法（SP法）测定粘附分子 (CD44V6 )、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子(HIF-1α)在非小细胞肺癌组织中的表达情况。结果 CD44V6 、HIF-1α和VEGF在NSCLC组织中阳性表达率分别为85.07%、61.19%和74.63%；CD44V6 、HIF-1α、VEGF蛋白表达与肿块大小、病理类型、组织分程度、淋巴结转移、临床分期密切相关，并且在非小细胞肺癌中的表达相互之间存在相关性；这3种蛋白的共表达与淋巴结转移、临床分期相关。结论 CD44V6 、HIF-1α和VEGF在NSCLC中的阳性表达与NSCLC的侵袭和转移密切相关。
【关键词】 CD44拼接异构体6 血管内皮生长因子 缺氧诱导因子-1α蛋白 非小细胞肺癌 免疫组化染色 炎性假瘤
Abstract：Objective This thesis aims to evaluate the relationship between the expression of CD44V6， HIF-1α，VEGF in non-small cell lung cancer (NSCLC ) and the behaviour of the invasion， metastasis of NSCLC. Methods The expressions of CD44V6，HIF-1α and VEGF were detected by immunohistochemical method. Results The positive expression of CD44V6， HIF-1α，VEGF in NSCLC was demonstrated in 85.07%，61.19% and 74.63% respectively. The expression levels of CD44V6， HIF-1α，VEGF were associated with tumor size， pathotype， histological differentiation， lymph nodal metastas，TNM stage(P&<0.05)， and there were significant correlations among them. The combined positive expression of CD44V6，HIF-1α， and VEGF was related to lymph nodal metastas， TNM stage(P&<0.05).Conclusions The expression of CD44V6， HIF-1α，VEGF in NSCLC correlates closely with the behaviour of the invasion， metastasis of NSCLC.
Key words:CD44V6;HIF-1α; VEGF; NSCLC; immunohistochemistry ; IPT
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。侵袭和转移是肺癌最本质的特性。随着肺癌研究的不断深入，对肺癌的治疗手段也在不断提高，分子靶向治疗已成为肿瘤治疗新的方向，各种生物分子治疗药物已开始用于临床。CD44V6、HIF-1a、VEGF是近年来发现与肿瘤的侵袭和转移有密切关系的因子。对其研究将进一步提高对肺癌侵袭和转移机制的认识，并指导临床治疗。本实验将用免疫组化方法在NSCLC中联合检测CD44V6、HIF-1a、VEGF3种因子，探讨这3种因子与NSCLC组织类型、分化、侵袭和转移的关系及它们之间的相关性。
１ 材料与方法
1.1 材料
标本来源于辽宁医学院附属第一医院病理科，为在2000—2005年期间手术及穿刺活检的67例非小细胞肺癌患者，并经病理证实。所有病人术前均未采取放疗、化疗和免疫治疗。67例患者中男性37例，女性30例，年龄40～75岁，平均62.5岁。所有标本按WHO（1981）组织学分级标准：鳞癌30例，腺癌37例(其中细支气管肺泡癌10例)；按分化程度分为低分化25例，高、中分化42例；有无淋巴结转移：淋巴结转移31例，无淋巴结转36例；肿瘤直径1～12 cm；所有病例均按国际肺癌 TNM分期（UICC，5 thed，1997）: Ⅰ期16例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例，Ⅳ期10例。另选例肺炎性假瘤10例作为对照。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋后存档。常规5 μm厚度连续切片，每个标本切4张片。
1.2 主要试剂
2008年2月，29(1)鼠抗人CD44V6多克隆抗体 (浓缩液，工作浓度 1∶50)，鼠抗人VEGF单克隆抗体 (浓缩液，工作浓度 1∶100)，柠檬酸盐（0.01M，pH7.2～7.4），DAB显色试剂盒S-P法免疫组化试剂盒等均购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗人多克隆抗体HIF-1α(浓缩液，工作浓度 1∶100) 武汉博士德生物技术有限公司。
1.3 免疫组化染色分析
SP常规染色，以试剂盒自带阳性切片同一条件下免疫组化染色结果为阳性对照；以PBS替代一抗的非小细胞肺癌组织免疫组化染色结果为阴性对照。
1.4 结果判定标准
CD44V6主要表达与肺癌细胞膜上，呈棕黄色颗粒状。HIF-1α主要定位于肿瘤细胞奖或细胞核中，呈棕黄色颗粒状。VEGF主要定位于肿瘤细胞奖中，呈棕黄色颗粒。每张切片高倍镜下任取4个视野，共计数1 000个细胞。按着色程度和着色率判定结果：无色为0分，浅黄色为1分，黄色2分，深黄色3分。细胞着色率＜1%为0分，1%～25%为1分，25%～50%为2分，﹥50%为3分。然后2项结果相加，超过2分者为阳性表达。
1.5 统计学处理
CD44V6，HIF-1α和VEGF表达与非小细胞肺癌组织临床病理关系，及其之间相互关系采用χ2检验及Spearman相关性分析，采用SPSS12.0软件包完成。
2 结 果
非小细胞肺癌组织中CD44V6、HIF-1α、VEGF蛋白阳性反应为细胞内呈黄色或棕黄色颗粒（见图1～3），本组研究发现67例非小细胞肺癌组织中CD44V6、HIF-1α、VEGF蛋白阳性表达总的阳性率分别为85.07%、61.19%和74.63%（表1 ），在炎性假瘤中的表达阳性率分别为30%、30%、40%，两者比较差异有显著性意义（表2）。3种蛋白的阳性表达与患者的性别、年龄均无关系。CD44V6 蛋白的阳性表达与肿瘤大小无关系，而与肿瘤组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期等密切相关，在肺癌TNM分期及在淋巴结转移各组间比较（表1， P＜0.05）; HIF-1α蛋白的表达与肿块大小有相关性（表1， P＜0.01）；与组织类型无关，在鳞状细胞癌、腺癌中的表达差异无显著性意义（表1，P&>0.05）；与组织分化程度、淋巴结转移、临床分期都有密切关系，在低分化肿瘤中的表达要明显高于高中分化 （表1 ，P＜0.01）；在淋巴结转移组中显著高于无转移组；HIF-1α基因在TNM 分期组间有显著性差异 （表1， P＜0.05）。VEGF蛋白表达与肿块大小有关（表1，P＜0.0１）；与组织类型无相关性，在鳞癌和腺癌中的表达无明显差异（表1 ，P&>0.05）；在低分化肿瘤中的表达要高于高中分化肿瘤，在淋巴结阳性组要高于阴性组；与TNM 分期有显著性差异（表1， P＜0.05）。
研究还发现，CD44V6 与VEGF、HIF-1α，以及VEGF与HIF-1α之间在非小细胞肺癌组织中的表达都有相关性，并且这3种蛋白的共表达与淋巴结转移、临床分期相关（表3、4 ）。表1 CD44V6，HIF-1α，VEGF在NSCLC中的表达与临床病理特征的关系类 表2 CD44V6，HIF-1α，VEGF在NSCLC与炎性假瘤中的表达比较类别总数表3 VEGF与 HIF-1α在非小细胞肺癌组织中的阳性共表达情况项表4 CD44V6，HIF-1α，VEGF共表达与NSCLC临床分期(TNM)临床分期例数CD44V6HIF-1αVEGF共表达非共表达共表达率(%) correlationPⅠ期
３ 讨 论
CD44是由单一基因所编码的具有高度异质性的单链膜表面糖蛋白家族，可与多种配体结合，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的粘附作用，发挥广泛的生物学功能［1］。其拼接变异体(variant isoform ofCD44，CD44v)－ CD44V6在肿瘤浸润、转移和预后中的作用，更引起了人们的重视。其明确的生理功能有:（1）细胞粘附聚集，参与细胞伪足形成和迁移运动；（2）细胞外基质的降解;（3）淋巴细胞的归巢;（4）骨髓和淋巴细胞的生成;（5）血管的生成;（6）细胞因子的释放;（7）保护细胞免受凋亡［2］。本试验研究发现CD44V6蛋白的阳性表达与肿瘤大小无关系，而与肿瘤组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期等密切相关；在鳞癌中表达高于在腺癌中的表达；随着肺癌细胞分化程度下降表达呈上升趋势，对高中和低分化肺癌组织进行比较，显示CD44V6蛋白的阳性表达在两组间具有显著性差异（P＜0.01），在肺癌p-TNM分期及在淋巴结转移各组间比较，差异亦有显著性（P＜0.05），在淋巴结转移阳性组要高于淋巴结转移阴性组；伴随着临床分期越晚其表达越高。其结果表明，CD44V6与肿瘤的恶性程度密切相关，肿瘤恶性程度越高，其表达越强；CD44V6参与了肿瘤侵袭和转移的过程；CD44V6表达增强的肿瘤有更高的侵袭和转移能力，这也意味着临床分期晚，预后更差，与大多数研究者的研究结果相一致［3］。