【摘要】 目的 ：探讨失血性休克大鼠肝脏组织组织因子(TF)、血栓调节蛋白(TM)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA) 和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的表达情况以及参附注射液的干预作用。方法：成年健康SD大鼠分成4组：对照组、休克组、林格液组、参附液组。对照组常规饲养，其余3组大鼠复制失血性休克模型。休克组不予治疗，林格液组用3倍失血量的林格液治疗，参附组用含参附注射液 (10 mL/kg)和林格液组成的3倍失血量的液体治疗。治疗后2 h取肝脏组织，－70 ℃保存，用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测肝脏组织中t-PA，PAI-1和TF，TM mRNA的表达。结果：①休克组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达与对照组相比明显升高（P &<0.05）。②林格液组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达与对照组及休克组比较明显升高(P &<0.05)。③参附液组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA与对照组相比较，差异无显著性，与休克组及林格液组比较表达有降低，差异有显著性(P &<0.05)。结论：休克状态下肝脏组织及内皮细胞损伤持续存在，参附注射液可使凝血活性下降，同时又可防止纤溶过度亢进。
【关键词】 失血性休克 组织因子 血栓调节蛋白 组织型纤溶酶原激活剂 纤溶酶原激活剂抑制物-1 参附注射液
Abstract: Objective: To explore the expression of tissue factor (TF)，thrombomodulin (TM)，tissue plasminogen activator (t-PA)，plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in rat liver after hemorrhagic shock，and the effect of Shenfu injection on them. Methods: Sprague-Dawley rats were pided into four groups: control group， hemorrhagic shock (HS group)， resuscitation with Ringer’s solution (RS group)，and resuscitation with Shenfu injection (SF group). The rats in control group were treated with regular feeding；the rest groups were subjected to hemorrhagic shock. Then，HS group was left without treatment， RS group was treated with Ringer’s solution with three times of volume of lost blood， SF group was treated with mixture of Shenfu injection (10 mL/kg) and Ringer’s solution with three times of volume of lost blood. The livers were collected after 2 hours of the treatment and stored at -70 ℃. The mRNA levels of tissue plasminogen activator antigen (t-PA:Ag)， plasminogen activator inhibitor-1 antigen (PAI-1:Ag)，thrombomodulin (TM) and tissue factor (TF) were measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Compared to the control group，mRNA levels of TF，TM，t-PA，PAI-1mRNA of HS group in liver were significantly increased (P &<0.05)；The mRNA levels of TF，TM，t-PA，PAI-1 in RS group increased significantly compared to those of control group (P &<0.05) and HS group(P &<0.05). The mRNA levels of TF，TM， t-PA， PAI-1 in SF group were significantly lower than those of RS group and the HS group (P &<0.05)， but there was not statistical difference compared to the control group. Conclusion: When hemorrhagic shock happens， the injury of liver and endothelial are persistently exist. Shenfu injection can prevent the formation of thrombus， improve microcirculation and less bleeding.
Key words: hemorrhagic shock；tissue factor；thrombomodulin；tissue-plasminogen activ-ator；plasminogen activator inhibitor-1；Shenfu injection
多年来，国内外关于休克的研究主要集中在炎症因子和抗炎治疗上。由于炎症与机体的凝血和抗凝血的动态平衡关系密切，抗凝也逐渐成为休克治疗新的靶点[1]。本实验观察了失血性休克时肝脏组织的组织因子(tissue factor，TF)、血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)、组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，t-PA)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等参与凝血、纤溶过程的物质的表达情况，以及参附注射液的干预作用，为临床上对失血性休克的治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组：清洁级健康SD大鼠40只，雌雄不拘，雌鼠不孕，体重250～300 g。由中国科学院上海分院实验动物中心提供。实验动物先置温州医学院实验动物中心层流实验室饲养2 d，自由摄食、摄水，室内温度25 ℃，相对湿度70%，12/12 h昼夜照明变化。大鼠随机分对照组、休克组、林格液组、参附液组。若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的，按随机原则补足。
1.1.2 主要试剂：参附注射液购于江苏先声药业公司(国药准字号:H33020465)；Trizol Reagent试剂为Invitrogen公司产品；RT-PCR试剂盒由Fermantas公司提供；引物及内参均由上海基康公司提供。
1.2 模型的建立及处理
实验前禁食过夜，自由饮水，操作前称重，在暖灯照射下进行操作。按4 mL/kg腹腔注射20%乌拉坦麻醉。①对照组：麻醉后分离左侧颈总动脉和右侧颈外静脉。用22-18 G动脉穿刺针行动脉插管，整个管道系统预充生理盐水液。动脉插管经三通及压力传感器连接多功能监护仪监测平均动脉压。在右侧颈外静脉穿刺、插管，后者用于输液。不予其他操作，于插管后3 h，取肝脏组织标本。②休克组：按
参考文献
[2]的方法，复制失血性休克动物模型。插管成功后，15 min内放血使平均动脉压降至5.33 kPa (40 mmHg)，稳定60 min，使其波动范围在（40±5）mmHg，即为模型复制成功；于2 h后取肝脏组织标本。③林格液组：模型复制成功后30 min内输注3倍失血量的林格液治疗，2 h后取肝脏组织标本。④参附液组：补液方案为参附注射液10 mL/kg，再输入林格液补充至3倍失血量，所有液体在30 min内输完；2 h后取肝脏组织标本，于-70 ℃冰箱中保存待检。1.3 RT-PCR检测肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA含量
①引物设计：大鼠各基因序列可在NCBI找到。采用Primer5.0计算机软件设计PCR所用引物，最后用BLAST验证。②Trizol试剂盒一步法分离提取总RNA：按照Invitrogen公司提供的Trizol试剂盒说明书步骤进行。③逆转录：将提取的总RNA取一部分立即进行逆转录。参考Takara公司提供的说明书进行操作。④PCR反应参考Takara公司提供的说明书进行操作，并按比例调整反应体系体积。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，计算机成像后以Gel3.0软件分析电泳图像的各mRNA相对表达量。
1.4 统计学处理方法
多组间相同指标的比较采用单因素方差分析，方差齐时采用Student Newman Keuls法，方差不齐同者采用Tamhane’s T2法。
2 结果
2.1 肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达结果
休克组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达与对照组相比明显升高，差异均有显著性（均P &<0.05）；林格液组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达较对照组及休克组升高，差异均有显著性(均P &<0.05)；参附液组肝脏组织TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达与对照组比较，差异无显著性，与休克组及林格液组比较明显降低(P&<0.05)。见表1和图1。
3 讨论
严重创伤病人易发生DIC，其中内皮细胞起着重要作用。内皮细胞不仅是创伤后炎症反应的参与者，还是首先受损的靶细胞。肝脏是一个高血流的器官，血管内皮细胞丰富，在创伤失血性休克时易出现功能损伤。内皮细胞具有表达TF启动外源性凝血途径，且同时又分泌TM发挥抗凝的作用，分泌t-PA激活纤溶及PAI-1发挥抗纤溶的功能。内皮细胞受损后，调节凝血、抗凝的功能下降，使机体凝血-抗凝系统紊乱，微循环产生障碍。TF的表达水平与内皮细胞损伤关系密切。TM是一种内皮细胞膜糖蛋白，是经典的血管内皮细胞损伤的一个分子标志物[5]。t-PA和PAI是调节纤溶活性的关键物质，由血管内皮细胞合成。t-PA为丝氨酸蛋白酶，能选择性地活化血凝块中的纤溶酶原生成纤溶酶，进而使纤维蛋白水解，血流通畅；PAI是t-PA最重要的抑制物，二者形成1:1复合物，使t-PA失去活性[6]，有内皮细胞损伤时，t-PA和PAI-1大量释放。
本实验研究发现失血性休克大鼠肝脏组织中TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA表达增强，与Besbas等[7]认为TM，t-PA，和PAI-1水平的升高反映内皮细胞的损伤和纤溶系统的激活颇相似。本实验林格液治疗后TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达较创伤对照组及休克组明显升高，提示林格液干预未见明显改善，反而有恶化作用，可能与缺血再灌注致内皮细胞损伤有关。参附注射液是由红参、附片等药提取物混合而成，能够稳定血流动力学，减轻肺缺血/再灌注[2]，增强机体非特异性抵抗力，抗休克双向调节血压。参附液复苏组与休克组及林格液复苏组比较，TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表达明显降低，提示组织及内皮细胞损伤后恢复且其对肝脏内皮细胞凝血、纤溶因子的表达产生影响，不易形成血栓，保持血管内血流通畅，改善微循环，同时，又防止纤溶过度亢进。有报道称，用参附注射液治疗大鼠肝缺血再灌注，发现肝实质细胞和肝窦内皮细胞损伤明显减轻，肝窦形态的改变和肝窦内的瘀血、白细胞聚集也明显减轻，也提示参附注射液通过保护肝窦内皮细胞，改善肝脏微循环灌注[8]。
参考文献
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