作者：白永恒，莫亚林，鲍丹莹，季敬璋，吕建新
【摘要】 目的 ：探讨维生素D受体(VDR)基因5’端启动子区域rs2238136和rs2228570位点单核苷酸多态性与前列腺癌发病风险的关系。方法：收集浙江地区122例前列腺癌患者和122例非癌对照人群的外周血标本，应用PCR-RFLP和测序技术分析5’端rs2238136和rs2228570位点的单核苷酸多态性的分布。结果：前列腺癌患者和对照人群rs2238136和rs2228570位点的基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡检验。rs2228570位点在对照人群中杂合子基因型CT占多数，为42.3%;最少为基因型TT，为28.5%;等位基因C和T则分别为50.4%和48.4%。rs2238136位点在对照人群中以纯合子基因型GG为主，为60.0%;AA最少，仅为11.4%。比较前列腺癌组和对照组rs2238136和rs2228570位点的基因型和等位基因分布频率，差异均无显著性(P &>0.05);VDR基因rs2238136在浙江汉族人群的分布与其他地区人群存在差异，而rs2228570位点人群间比较则差异无显著性。结论：VDR基因多态性分布存在种族差异性;VDR基因5’端rs2238136和rs2228570位点的单核苷酸多态性与浙江汉族人群前列腺癌发病、发展并无直接的相关性。
【关键词】 VDR基因;单核苷酸多态性;限制性片段长度多态性;前列腺癌
Abstract: Objective: To investigate the relationship between rs2238136 and rs2228570 polymorphisms in 5’ promoter region of vitamin D receptor (VDR) gene and prostate cancer (PCa) risk. Methods: Samples of blood were collected from 122 prostate cancer patients and 130 non-cancer male controls in Zhejiang Area. The genotypes were analyzed with PCR-RFLP and sequencing. Results: The frequency distribution of rs2238136 and rs2228570 genotypes conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium test (P &>0.05). The frequencies of rs2228570 genotype‘CT’in controls was 42.3%， but‘TT’only 28.5% ;the frequency of rs2238136 genotype‘GG’was 60.0%，but‘AA’only 11.4%. The frequencies of rs2238136 and rs2228570 genotypes and alleles showed no significant difference between PCa patients and controls， and significant differences were found in the distribution of VDR rs2238136 polymorphism in different ethics， but nor of the rs2228570. Conclusion: The frequency distribution of VDR gene polymorphisms varies in different ethics populations ;rs2238136 and rs2228570 polymor-phisms are not related directly to the risk of prostate cancer in Zhejiang Han population.
Key words: VDR gene;single nucleotide polymorphism (SNP);RFLP;prostate cancer
前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界不同地域和不同人群中发病率存在明显差异。近年来研究发现，维生素D的活性形式1，25(OH)2D3水平在PCa的病因学中起着重要的作用[1-2]。1，25(OH)2D3通过与核内维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合，发挥对肿瘤细胞生长增殖的调控作用[3]，因此，研究VDR基因能深入了解PCa发病的分子机制。本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和测序技术对中国浙江汉族人群的VDR基因启动子区域rs2238136和rs2228570位点单核苷酸多态性进行检测，来探讨VDR基因与PCa易感性的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 自2007年4月至2008月9月间收集浙江地区122例PCa患者和130例非癌对照人群的外周血标本。PCa患者的诊断均经组织病理证实。对照组均来自体检人群，无相关临床症状以及疾病史，且具有较低的血清总PSA水平，B超检查结果均正常。
1.2 方法
1.2.1 全基因组DNA提取。用全血DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取外周血基因组DNA，置于4 ℃保存，备用。
1.2.2 引物设计：根据GenBank(gi：89161190)VDR基因标准序列，应用Primer 5.0软件设计引物，引物由TaKaRa公司(日本)合成。
扩增rs2238136位点的引物为：5’CAGGGATTG AGGATAGGAAAGC3’(正向)和5’ TCTGATGCCAACAG GAGGTGA 3’(反向);
扩增rs2228570位点的引物为：5’AGCTGGCCC TGGCACTGACTCTGCTCT3’(正向)和5’ATGGAAACA CCTTGCTTCTTCTCCCTC 3’(反向)。
1.2.3 基因分型。PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，25 mmol/L的MgC12 3.5μL，各含2.5 mmol/L的dNTP混合液4.5μL，10μmol/L的引物P1和P2各0.5μL，80～200 ng DNA模板，5 U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，加水至50μL。PCR条件：94 ℃ 5 min，35个循环(94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s)，72 ℃ 5 min，PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增rs2228570位点的PCR产物10μL用Fok I 65 ℃酶切消化4 h，酶切体系为30μL，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增rs2238136位点的PCR产物通过纯化后，送上海基康公司测序。
1.3 统计学处理方法 对研究人群的VDR基因rs2238136和rs2228570位点基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，应用SPSS13.0对其进行统计分析，包括Logistic回归分析(OR值和95%CI)等。
2 结果
2.1 限制性内切酶切电泳结果 rs2228570位点PCR产物用Fok I酶切消化后所得到的电泳图(见图1)，PCR扩增目的片段长度为267 bp，当存在酶切位点时，PCR产物被切成197 bp和70 bp。PCR产物经纯化测序后显示rs2228570位点存在C和T的变异。
2.2 测序结果 rs2238136位点经测序后，发现存在碱基G和A的变异(见图2)。
2.3 Hardy-Weinberg平衡检验结果 对PCa患者和对照人群VDR基因rs2238136和rs2228570位点的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，三组资料检测得到基因型观察值与预期值的差异均无显著性(P&>0.05)，表明收集的资料具有代表性。
2.4 rs2238136和rs2228570位点的基因型和等位基因分布情况 rs2228570位点在对照人群中杂合子基因型CT占多数，为42.3%，最少为基因型TT，为28.5%;C和T等位基因则分别占50.4%和49.6%。rs2238136位点在对照人群中以纯合子基因型GG为主，为60.0%，AA最少，仅为11.4%。分别比较PCa组与对照组间rs2238136位点多态性分布情况，发现其基因型和等位基因分布频率差异均无显著性(P &>0.05)，见表1。同样，分析rs2228570位点的基因型和等位基因分布频率在PCa与对照组中的分布，其差异亦无显著性(P &>0.05)。
2.5 rs2238136和rs2228570位点的基因型和等位基因在不同人群中的分布情况 浙江汉族人群和沈阳地区汉族人群以及日本人群rs2238136的基因型和等位基因分布差异具有显著性(P&<0.05)，浙江地区汉族人群GG基因型和G等位基因分布频率较沈阳汉族人群高，且也比日本人群高;浙江汉族人群rs2228570位点的基因型和等位基因分布与其他人群差异无显著性(P &>0.05)，见表2。
3 讨论
人类VDR基因定位于12号染色体长臂1区3带(12q13)上，全长65 kb，存在多个限制性内切酶酶切位点，其中常见的位点包括第8内含子的BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)，第9外显子的TaqI(rs731236)以及3’端PolyA微卫星等。研究显示[4-5]，这些多态性位点可能潜在地影响VDR mRNA的稳定性和外周血中1，25(OH)2D3水平，而后者在PCa的发生、发展中起着重要的作用，因此，推测VDR基因多态性可能与PCa有关[2]。
本研究的rs2238136(cdx-2)和rs2228570(Fok I)位点分别位于VDR基因5’端的内含子1E和外显子2上，分别存在着碱基G和A、T及C的变异。对于rs2238136的多态性与疾病的报道，目前多集中于骨质疏松、肠道肿瘤等，而与前列腺肿瘤的相关报道较少。本研究通过对浙江人群的病例对照研究发现，rs2238136和rs2228570基因型和等位基因分布频率的差异均无显著性，显示其与前列腺癌发病无关。我们对rs2238136位点的多态性和前列腺癌的关系的研究结果与研究北美人群[6]一致，即两者不相关。对rs2228570位点的多态性和前列腺癌的关系，我们与其他人群的研究结果存在一定的差异。Yang等[7]对中国湖北地区汉族人群进行研究，结果显示VDR基因rs2228570的多态性与前列腺癌不相关。Chokkalingam等[8]对上海人群的研究也得出了同样的结果，然而他们却发现携带有rs2228570“TT”基因型的个体具有更高的IGFBP-3表达水平，而后者与细胞分裂增殖密切相关，提示rs2228570“TT”基因型可能与前列腺癌发病相关。在对美国人群进行研究时，Xu等发现携带有rs2228570‘C’等位基因的个体能明显增加前列腺癌恶化的风险，显示rs2228570‘T’等位基因可能具有对前列腺癌的保护作用。这种基因多态性与前列腺癌的关系在不同人群中结果的差异，推测可能与种族遗传背景不一致有关，也就是说单核苷酸多态性在不同地域和种族中的分布具有自己的独特性。
通过对不同地区人群rs2238136和rs2228570基因型和等位基因分布频率的比较研究我们发现，浙江地区汉族人群rs2228570多态性分布与其他人群无差异，但rs2238136基因型和等位基因分布则与其他人群差异明显，这种特征性分布进一步证实我们的推测，单核苷酸多态性在人群中的分布具有差异性，这可能是造成疾病发病率不同的原因之一。
我们的结果显示，rs2238136和rs2228570位点单核苷酸多态性虽然与PCa发病并无直接的联系，但它们与周围的其他多态性位点是否存在着连锁不平衡关系目前尚未知晓。因此，rs2238136和rs2228570位点多态性与PCa的关系还需更大量的样本和更多的位点进行深入连锁分析，才能得到更准确的结论。
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