作者：林巍，王小同，李宁，徐漫欢，杨汉文
【摘要】 目的 ：观察脑活素（施普善）对慢性低氧高二氧化碳大鼠学习记忆功能的影响及大鼠海马中caspase-3表达的变化，并探讨可能的作用机制。方法 ：筛选八臂迷宫训练后清洁级的雄性SD大鼠32只，随机均分为对照组、模型组、施普善1 mL/kg组和施普善2.5 mL/kg组。采用八臂迷宫观察干预前后大鼠空间学习记忆能力的变化，Western-blot法检测大鼠海马caspase-3蛋白的表达。结果：与对照组比较，模型组大鼠空间学习记忆能力下降，海马中caspase-3明显增高。与模型组大鼠比较，2种剂量施普善干预组大鼠的学习记忆能力明显改善，且海马中caspase-3的表达减少。结论：施普善具有改善慢性低氧高二氧化碳大鼠空间学习记忆作用，可能与抑制海马中caspase-3表达有关。
【关键词】 施普善；低氧；高二氧化碳血症；学习记忆；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；海马；大鼠
Abstract: Objective: To observe the effects of cerebrolysin on the learning-memory function and the changes of caspase-3 expression in the hippocampus of rats model with chronic hypoxia and hypercapnia，and to explore the probable mechanism. Methods: Thirty-two male S-D rats trained by eight-arm radial maze were pided into four groups: rats in the control group without treatment ；rats in chronic hypoxia and hypercapnia group were placed in the special closed cabin with hypoxia and hypercapnia for 8 hr a day， 6 day a week， 4 weeks and injected intraperitoneally with saline ；the rats in two treating group were injected intraperitoneally with 1 mg/kg and 2.5 mg/kg cerebrolysin， respectively. The learning-memory ability was measured using eight-arm radial maze and the expression of caspase-3 in the hippocampus was decteced with Western-blot.Results: Compared with the control group，the learning-memory ability was declined markedly and the expression of caspase-3 was increased significantly in chronic hypoxia and hypercapnia group. Nevertheless， the improvement of learning-memory and the less caspase-3 expression were observed in rats treated by two doses of cerebrolysin. Conclusion: Cerebrolysin may improve the learning-memory ability in rats with hypoxia and hypercapnia， which may be associated with the inhibition of the expressin of caspase-3 in the hippocampus.
Key words: Cerebrolysin；hypoxia；hypercapnia；learning-memory；caspase-3；hippocampus；rats
慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者存在不同程度的认知功能障碍[1]，但其机制目前尚不清楚。王小同等[2]在一系列研究中，证实慢性低氧高二氧化碳动物模型大鼠存在空间学习和记忆障碍。施普善含有85%的游离氨基酸和15%低分子量生物活性肽，极易通过血脑屏障，具有神经保护和神经营养作用，已广泛应用于痴呆、脑卒中、脑外伤等引起的脑功能障碍治疗，取得良好的临床疗效。本研究建立慢性低氧高二氧化碳大鼠模型，观察施普善对其学习记忆功能障碍的治疗作用及脑组织caspase-3蛋白表达的变化，并探讨其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 材料
常压低氧高二氧化碳舱（温州医学院肺心病研究室研制），Medlab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司），八臂迷宫（温州医学院神经药理研究所），八臂迷宫饲饵（浙江大学医学院药学院），施普善（Cerebrolysin，奥地利Ebewe药厂，批号608260），caspase-3 抗体（Cell Signaling Technology公司），GAPDH优质内参（上海康成生物工程有限公司）
1.2 动物分组和模型制备
清洁级SD大鼠（温州医学院实验动物中心提供）44只，体重280～310 g，经八臂迷宫训练淘汰12只。32只大鼠随机均分为4组：①对照组；②慢性低氧高二氧化碳组（模型组）；③慢性低氧高二氧化碳施普善（1 mL/kg）干预组（施普善1 mL/kg组）；④慢性低氧高二氧化碳施普善（2.5 mL/kg）干预组（施普善2.5 mL/kg组）。后3组大鼠适应性饲养3 d后，置于常压低氧高二氧化碳舱(氧浓度在9%～11%，二氧化碳浓度在5.5%～6.5%，舱内温度23～26 ℃，湿度50%～70%)内，每天8 h，在入舱前半小时按规定剂量分别予以腹腔注射生理盐水和施普善；其余16 h放置于正常环境中。每周6 d，连续4周。
1.3 行为学测试
八臂迷宫测试：训练方法参照文献[3]方法进行训练，称量自由摄食状态下大鼠的体重，训练前大鼠禁食1 d，其后限食1 d，使其体重降至原体重的85%左右，在整个训练期间限食并维持原体重的85%左右。大鼠在迷宫中预适应2 d，每天1次，第1天在八个臂中均撒上饵片任其自由摄食饵片10 min，第2天在固定的四臂中散上饵片（1、2、4、7臂），任其在迷宫中寻找食物10 min。训练时，在选定的（1、2、4、7）臂中放置饵片，该次序维持到训练结束不变，将大鼠放于迷宫中央区，用小桶盖住，在迷宫中适应15 s后提起小桶放出大鼠，大鼠可以自由选择任意一臂摄取饵片。大鼠进入有饵片的臂并摄取了饵片为一次正确的选择不做记录，重新进入放饵片的臂称为工作记忆错误（working memory error，WME），第一次进入不放饵片的臂称为参考记忆错误（reference memory error，RME），两者之和为总的记忆错误（total memory error，TE）。训练成功的标准：连续5次训练错误选择次数为≤1次，同时WME必须为零。
1.4 caspase-3测定
大鼠断头处死，全脑取出置于冰盘上，依次取出皮层、海马，去除脑膜和血管，迅速称重后保存于液氮备用。取部分组织按1:10（密度:体积）加入细胞裂解液，冰上匀浆，13 000 g离心20 min收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白(20～50μg)经12%SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST室温封闭1 h；加入相应一抗（Caspase-3及内参抗体GAPDH，1:1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入HRP标记的相应二抗（1:10 000）室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次；ECL试剂作用5 min，X光胶片曝光。冲洗并扫描后结果用quality one软件分析杂交条带灰度值，以GAPDH水平为内对照。
1.5 统计学处理方法
组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 各组八臂迷宫测试结果
与对照组比，模型组大鼠WME错误次数和TE明显增多，差异有显著性（P &<0.05）；与模型组相比，1 mL/kg和2.5 mL/kg施普善干预组WME和TE错误次数均明显减少，差异有显著性（P &<0.05）。施普善两组之间TE、RME、WME差异无显著性（见图1）。
2.2 各组海马中caspase-3的表达
如图2所示。与对照组比，模型组海马中caspase-3的表达明显增高，差异有显著性（3.287±0.682 vs 0.523±0.131，P &<0.001）；2.5 mL/kg施普善干预组海马caspase-3的表达明显增高（1.460±0.735 vs 0.523±0.131，P＝0.009），而1 mL/kg施普善干预组无明显增高（0.676±0.271 vs 0.523±0.131，P＝0.637）。与模型组相比，1 mL/kg和2.5 mL/kg施普善干预组海马caspase-3的表达明显减少，差异有显著性（P&<0.001）。2.5 mL/kg施普善干预组海马caspase-3的表达显著高于1 mL/kg施普善干预组，差异有显著性（P＝0.017）。
3 讨论
本实验模型组大鼠的WME，TE的错误次数均明显增加，而RME增加不明显。可见，慢性低氧高二氧化碳模型大鼠有空间学习记忆和工作记忆能力受损，且以短时记忆受损为著，与临床上COPD患者的表现相似。
既往研究[4]发现，施普善具有类似神经生长因子样作用，可重建皮层微管相关蛋白水平，恢复神经元正常细胞骨架，增加海马和皮层树突分支和突触密度，影响血脑屏障葡萄糖载体的表达，增加大脑葡萄糖运输，改善神经元的能量代谢，从而发挥其神经营养活性。切除海马穹隆伞造成学习记忆功能障碍的大鼠，给予施普善治疗后，不仅改善记忆能力，而且改善获得新信息的能力[5]。本实验显示，施普善干预组大鼠的TE，WME，RME错误次数较模型组明显减少，认知功能明显改善，提示1 mL/kg和2.5 mL/kg两种剂量施普善具有快速改善慢性低氧高二氧化碳引起的认知功能障碍的作用。
动物实验证实，慢性低氧可导致脑组织结构和功能的损害，细胞凋亡在其中起着重要作用。喻林升等[6]研究发现，与对照组相比，慢性低氧高二氧化碳模型大鼠脑微血管和神经元的超微结构发生改变，神经元变性、坏死和凋亡，海马神经元的凋亡尤为明显。徐浩等[7]实验进一步证明，慢性低氧高二氧化碳可诱发大鼠海马神经细胞凋亡。已有研究报道，大鼠学习记忆功能受损与海马神经元的凋亡有密切关系[8]。Barhwal等[9]发现低氧环境中雄性Sprague Dawley大鼠水迷宫测试中工作记忆能力下降，海马中凋亡蛋白如caspase-3表达明显增高。本试验发现模型组大鼠海马的凋亡因子caspase-3表达显著增强，而1 mL/kg和2.5 mL/kg两种剂量施普善干预组大鼠海马组织中caspase-3表达明显下降。可见，慢性低氧高二氧化碳增加了大鼠海马组织的细胞凋亡，而施普善的干预抑制了大鼠海马组织的细胞凋亡，从而减轻海马组织的损害。
Hartbauer等[10]采用低血清（2%胎牛血清）培养基的鸡胚端脑神经元细胞应激模型，观察施普善对神经元活性和程序性细胞死亡的影响，发现施普善治疗后的培养基中神经元，凋亡相关的染色质改变显著减少，证实脑施普善的肽类成分具有抗凋亡作用，从而发挥长期的神经保护效应。Yuan等[11]等研究表明，施普善可能通过调节细胞凋亡级联反应，尤其通过caspase等因子的激活，从而引起细胞色素C释放、Apaf-1复合体形成等发挥作用。当然，施普善对于海马神经元抗凋亡的保护机制目前仍不清楚，有待进一步的研究证实。
参考文献
[1]Ozge C，Ozge A，Unale O. Cognitive and functional deterio-ration in patients with severe COPD[J]. Behav Neurol， 2006，17(2):121-130.
[2]王小同， 陈松芳， 邵胜敏， 等. 慢性低氧高二氧化碳对大鼠认知功能与CREB表达的影响[J]. 温州医学院学报，2007，37(5):418-421.
[3]Huang YW， Chen Z， Hu WW， et al. Facilitating effect ofhistamine on spatial memory deficits induced by dizocilpineas evaluated by 8-arm radial maze in SD rat[J]. ActaPharmacol Sin， 2003， 24(12):1076-1270.
[4]Ruether E， Ritter R， Apecechea M， et al. Sustained improve-ments in patients with dementia of Alzheimer's type (DAT)6 months after termination of Cerebrolysin therapy[J].Jour-nal of Neural Transmission， 2000， 107(7):815-829.
[5]Francis-Turner L， Valouskova V. Nerve growth factor andnootropic drug Cerebrolysin but not fibroblast growth factorcan reduce spatial memory impairment elicited by fimbria-fornix transection: short-term study[J]. Neurosci Lett，1996，202(3):1-4.
[6]喻林升， 张旭， 高申孟. 慢性低O2高CO2大鼠脑神经细胞凋亡及P53蛋白表达研究[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2002，9(3):178-179.
[7]徐浩， 王小同， 徐漫欢， 等. 慢性低O2高CO2对小鼠神经元凋亡及硝基酪氨酸表达的影响[J].温州医学院学报， 2007， 37(6):519-521.
[8]Lucassen PJ， Vollmann-Honsdorf GK， Gleisberg M， et al.Chronic Psychosocial stress differentially affects apOptosisin hippocampal subregions and Cortex of the adult tree shrew[J].Eur J Neurosci， 2001， 14(1):161-166.
[9]Barhwal K， Singh SB， Hota SK， et al. Acetyl-L-carnitineameliorates hypobaric hypoxic impairment and spatialmemory deficits in rats[J]. Eur J Pharmacol. 2007， 570(1-3):97-107.
[10]Hartbauer M， Hutter-Paier B， Skofitsch G， et al.Antiapoptoticeffects of the peptidergic drug Cerebrolysin on primary cul-tures of embryonic chick cortical neurons[J]. J NeuralTransm， 2001， 108(4): 459-473.
[11]Yuan J，Lipinski M，Degterev A.persity in the mechanismsof neuronal cell death[J].Neuron， 2003， 40(2):401-413.