作者：张琼，黄慧聪，梁韶晖，潘长旺
【摘要】 目的 ：寻找阴道毛滴虫的特异蛋白质并探讨白头翁对其蛋白质差异表达的影响。方法：用固相pH梯度二维凝胶电泳分离阴道毛滴虫总蛋白，凝胶用银染显色，PDQuest7.4.0软件分析。结果：正常对照组找到蛋白质点平均（435±17）个，匹配率为92.5%；白头翁组找到蛋白质点平均（343±9）个，匹配率为94.9%。定性分析，正常组和白头翁组共有58个表达差异点，其中只在正常组中表达的点有45个， 只在白头翁组表达的点有13个 ；定量分析，白头翁组和正常组比较，表达增加大于2倍的点有43个，降低50%以上的点有50个。结论 ：建立了阴道毛滴虫正常组和白头翁组的二维凝胶电泳图谱，识别了151个差异表达的蛋白质，白头翁杀灭阴道毛滴虫的过程中上述蛋白质发生了质或量的改变。
【关键词】 阴道毛滴虫；白头翁；蛋白质组；二维电泳
Abstract: Objective: To search the characteristic proteins of Trichomonas vaginalis（T.v）and explore the influence of Pulsatilla chinensis on discrepancy protein expression. Methods: The proteins of T.v were separated with immobilized pH gradient-based two-dimensional gel electrophoresis(2-DE). After silver staining， PDQuest 7.4.0 software was used to analyse 2-DE images. Results:About 435±17 and 343±9 protein spots were found in the two maps of normal group and Pulsatilla chinensis group，respectively：The match ratio was 92.5% and 94.9% respectively. Fifty-eight different proteins were observed between the normal group and Pulsatilla chinensis group with qualitative analysis， of which 45 proteins were expressed only in the normal group， 13 protein was expressed only in the Pulsatilla chinensis group ；43 spots were found increased that showed a two fold increase and 50 spots were found decreased that showed 50% decrease at least as comparing to normal group with quantitative analysis. Conclusion: 2-DE protein expression profiles of T.v， including normal group and Pulsatilla chinensis group are established ，and 151 different proteins are found. In the process of Pulsatilla chinensis kills T.v， the qualitative or quantitative change takes place in the above-mentioned protein.
Key words: Trichomonas vaginalis；Pulsatilla chinensis；proteome；two-dimensional electrophoresis
阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis Donne，1837)是一种寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛虫，可引起滴虫性阴道炎、前列腺炎和泌尿系统炎症[1]。滴虫病被认为是最流行的性传播疾病（STD）之一[2-5]。研究表明，白头翁具有明显的杀灭阴道毛滴虫作用，0.625～5 mg/mL浓度的药物对滴虫均具有抑制、杀灭和裂解作用[6]，但药物杀虫机制中对虫体蛋白质组表达的影响尚未见报道。阴道毛滴虫全基因组序列已于2007年公布。目前，国外关于阴道毛滴虫全虫可溶性蛋白的二维电泳图谱已有报道[7]，而用药前后的差异蛋白质组学研究尚未见报道。本研究采用二维电泳技术，比较正常死亡组和白头翁作用死亡组阴道毛滴虫蛋白质表达的差异，为从蛋白质水平初步探索白头翁体外抗阴道毛滴虫的杀虫机制奠定基
1 材料和方法
1.1 试剂
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、超纯尿素(ultraurea)、硫脲(thiourea)、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰氨、固相pH干胶条(17 cm，pH 4～7)、Bio-lyte pH 3～10、2-D clean up试剂盒等(Bio-Rad公司)；蛋白酶抑制剂混合液(Sigma公司)；所有溶液均用MilliQ水配制。
1.2 仪器设备
PROTEAN IEF CELL等电聚焦仪，PROTEANIIXi垂直板电泳仪及其附件，GS-800扫描成像系统，PDQuest凝胶图像分析软件(Bio-Rad公司)，UV722s紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.3 虫体的收集
1.3.1 实验标本：虫体分离自温州东方女子医院阴道炎患者的阴道分泌物，参照文献[8]方法接种于肝浸汤培养基（pH 5.8），37 ℃无菌培养，24 h传代一次。
1.3.2 药物制备：白头翁20 g(购自温州医学院附属第一医院)，置400 mL双蒸水中，浸泡过夜，然后煮沸30 min，收集药液；再加水200 mL，继续煮沸30 min，取出药液并与首次药液混合，过滤除去残渣，加热浓缩至40 mL，药液生药浓度为500 mg/mL。3 000 r/min离心10 min，取上清，置无菌瓶中，4 ℃保存。
1.3.3 培养基：肝浸汤培养基，8磅20 min高压灭菌后4 ℃保存，培养前加10%灭活小牛血清及青霉素和链霉素各1 000 U/mL，分装培养管，每管培养基体积为5 mL。
1.3.4 正常组与药物组虫体的收集：参照文献[6]，取培养24 h 滴虫分别接种于含1.25 mg/ mL白头翁和对照组(不加药)培养基中，每组各7管，虫体浓度为2×106个/mL，37 ℃温箱培养。白头翁组作用4 h后，显微镜观察虫体绝大多数由梨形或椭圆形变圆，运动减慢，胞质内颗粒明显增多，空泡增大，空泡数目一个到数个不等，常位于虫体边缘。最终虫体停止运动，胞质内充满颗粒后将培养液收集起来3 000 r/min离心5 min，去掉上清，PBS（pH 7.4）洗3次（12 000 r/min离心3 min），离心沉淀，最后将上清尽量除干净，收集的虫体于-80 ℃冻存备用。正常对照组滴虫持续培养至出现上述变化后，按同样方法收集、冻存。
1.4 2-DE蛋白样品的制备
将收集的两管沉淀（正常组和白头翁组）中各加入100μL裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、 2 mmol/L TBP、0.2% Bio-Lyte pH 3～10、5 mL/L蛋白酶抑制剂混合液)，分别用研磨棒在冰上研磨，使其充分溶解，然后每管各加入2μL DnaseI(30 U/μL)、8μL RNaseA(25μg/μL)，室温静置20 min，再每管各加300μL裂解液，混匀后冰上超声裂解（超声2 s，间隙10 s，总共时间2 min，保护温度30 ℃，功率80 W），室温静置，待裂解液作用1 h以上后，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，取上清，用2-Dclean up试剂盒处理，Bradford法[9]测定蛋白量。分装后-20 ℃冻存备用。
1.5 电泳
1.5.1 二维凝胶电泳：按
参考文献
[10]的方法， 根据样品情况适当改进。第一向等电聚焦：将300μg样品与上样缓冲液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、2 mmol/L TBP、0.2% Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝)混合后开始等电聚焦。电压设置为50 V 12 h、250 V 0.5 h、1 000 V 1 h， 线性升压3 h至10 000 V后聚焦70 000伏小时(Vh)。聚焦后的胶条依次在含1% DTT和4%碘乙酰胺的平衡缓冲液(6 mol/L尿素、2% SDS、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8、30%甘油)中各平衡15 min，转移至15%聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封顶。第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：以恒流15 mA/gel电泳15 min，再加大电流至30 mA/gel直至溴酚蓝达到胶的底端。参照文献[11]的方法银染。1.5.2 凝胶图像的采集和分析：用GS-800透射扫描，分辨率为63.5 micron×63.5 micron。图像配比分析采用PDQuest7.4.0分析，比较蛋白质点差异。
2 结果
2.1 二维电泳
在相同条件下， 同组实验重复2次。用PDQuest软件分析，其中正常死亡组蛋白质点有（435±17）个，匹配率平均为92.5%；白头翁作用死亡组蛋白质点有（343±9）个，匹配率平均为94.9%，具有较好的重复性。蛋白质双向电泳图谱(见图1)，从左到右等电点增加，从下往上分子质量增加，蛋白质点主要分布在pH 5～6.9。分子量在116～25 kDa的蛋白点分布较密集，其等电点多位于5～6.9之间；分子量在25 kDa以下的蛋白点分布较均匀，其等电点在4～6.9之间。
2.2 凝胶图像的分析
定性分析，正常组和白头翁组共有58个表达差异点，其中只在正常组中表达的点有45个，只在白头翁组表达的点有13个；定量分析，白头翁组和正常组比较，表达增加大于2倍的点有43个，降低50%以上的点有50个，其中分子量在25 kDa和66.2 kDa之间的蛋白质点表达明显增强，分子量在25 kDa以下的蛋白质点表达明显下降，数量明显减少。应用PDQuest分析软件初步确定了这些差异蛋白的分子量和等电点，发现其等电点多分布在5～6之间，分子量多分布在66.2 kDa以下。图2箭头所指为两组比较部分表达明显差异的点。
3 讨论
3.1 滴虫病的治疗
滴虫性阴道炎近年有增加趋势，目前有多种抗滴虫性阴道炎的药物，主要通过在滴虫体内转变为还原形式产物而破坏其脱氧核糖核酸（DNA）的结构，从而扰乱滴虫DNA模板功能进而抑制其生长，同时对局部刺激性较强。如临床上治疗阴道毛滴虫感染的常用药物甲硝唑存在诱导耐药虫株和致突变等严重问题。疫苗接种可使人群获得持久和较强的免疫力，但抗原诱导宿主的保护性免疫反应与利用该抗原制备疫苗和生产疫苗至临床应用之间尚有很大距离，因而寻找新的、高效、低毒的替代药物具有现实意义。据文献资料显示，传统中药白头翁对阴道毛滴虫具有明显的杀灭和抑制作用。闫艳等[12]从超微结构的变化方面探讨了白头翁的杀虫机制，发现白头翁作用可损伤虫体内部结构，引起多种细胞器受损。关于白头翁杀灭阴道毛滴虫过程中对其蛋白质组表达的影响目前尚未见报道。
3.2 本次实验成果
本次实验采用二维电泳技术，建立了阴道毛滴虫正常死亡组和白头翁作用死亡组的双向凝胶电泳图谱，结果显示阴道毛滴虫的蛋白质分子量大多数位于66.2 kDa以下，等电点大多数位于5～6.9之间，提示阴道毛滴虫蛋白质多为偏酸性小分子量蛋白。张跃等[14]用SDS-PAGE分析阴道毛滴虫全虫可溶性抗原，结果显示分子量在72 kDa以下的占89.5%，与本实验结果相符。Jose等[7]用二维电泳分析阴道毛滴虫全虫可溶性抗原，分离出约700个考马斯亮蓝染色斑点，其多肽图谱与本实验结果也不尽相同，这可能由于实验条件不同所致，分析其原因如下：①挑选样品标准不同：Jose等研究阴道毛滴虫全虫蛋白质组学，样品来源于活虫；本实验目的是探讨阴道毛滴虫药物作用死亡与正常衰老死亡的差异蛋白质组学，样品来源于死亡虫体。②实验条件不同：蛋白质斑点数目与胶条规格有关，双向电泳的分离能力取决于二维上的长度，Jose等使用的胶条为18 cm，本实验采用的是17 cm胶条，通常认为蛋白质斑点数目与有效的分离面积成正比；Jose等使用考染，蛋白总上样量500μg，本实验使用银染，蛋白总上样量300μg；Jose等二向SDS-PAGE浓度为12.5%，本实验为15%；样品分离方法、实验仪器等方面也不尽相同。Jose等鉴定出的阴道毛滴虫的116个功能蛋白中，参与糖代谢（占81.8%）、蛋白质折叠（占88.9%）、氨基酸代谢（占100%）的绝大多数蛋白质的分子量位于25 kDa和66.2 kDa之间，本次实验结果提示白头翁在体外抗阴道毛滴虫的过程中，该类功能蛋白的合成和表达有可能增强；同时，参与电子转移（占72.7%）、新陈代谢（占62.5%）、蛋白质合成（占100%）的绝大多数蛋白质的分子量位于25 kDa以下，本次实验结果提示上述功能蛋白的合成和表达有可能减弱，有些功能蛋白在药物作用下可能不表达。进一步应用质谱鉴定技术、氨基酸序列分析和数据库检索等蛋白质组学方法，将有助于确定上述差异蛋白点究竟是已知蛋白还是未知的新蛋白，可为揭示白头翁的杀虫机制提供新的实验依据。
参考文献
[1]van Der Schee C， van Belkum A， Zwijgers L， et al. Improveddiagnosis of Trichomonas Vaginalis infection by PCR usingvaginalswabs and urine specimens compared to diagnosis bywet mount microscopy ， culture ， and fluorescent staining[J]. J Clin MICrobiol， 1999，37(12):4127-4130.
[2]Viikki M， Pukkala E， Nieminen P， et al. Gynaecologicalinfections as risk determinants of subsequent cervicalneoplasia[J]. Acta Oncologica，2000，39(1):71-75.
[3]Heine P， McGregor JA. Trichomonas vaginalis: a reemerg-ing pathogen[J]. Clinical Obstetrics and Gynecology，1993，36(1):137-144.
[4]Petrin D， Delgaty K， Bhatt R， et al. Clinical and microbio-logical aspects of Trichomonas vaginalis[J]. Clinical Micro-biology Reviews，1998，11(2):300-317.
[5]Garcia AF， Chang TH， Benchimol M， et al. Iron and contactwith host cells induce expression of adhesins on surface ofTrichomonas vaginalis[J]. Mol Microbiol，2003 47(5):1207-1224.
[6]闫艳，高兴政. 白头翁体外抗阴道毛滴虫的效果及扫描电镜观察[J].中国寄生虫病防治杂志，2003，16 (6):353 -355.
[7]Jose Batista De Jesus JB， Patricia Cuervo P， Magno JunqueiraM， et al. Application of two- dimensional electrophoresisand matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry for proteomic analysis of the sexuallyransmitted parasite Trichomonas vaginalis[J]. J MassSpectrom，2007， 42(11):1463-1473.
[8]郭步平，李宇飞. 不同 pH 肝浸汤培养基培养阴道毛滴虫的观察[J].中国病原生物学杂志，2006，1(1):20-21.
[9]Kruger NJ. The Bradford method for Protein quantitation[J]. Methods Mol Biol，1994，32(1):9-15.
[10]辛普森，理查德J. 蛋白质与蛋白质组学实验指南[M]. 北京:化学工业出版社，2006:131-145.
[11]郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京:科学出版社，1999:141-142.
[12]闫艳，高兴政. 白头翁体外抗阴道毛滴虫透射电镜观察[J].中国病原生物学杂志，2006，1(1):22-23.
[13]Gorg A， Weiss W， Dunn MJ. Current two-dimensional elec-trophoresis technology for proteomics[J]. Proteomics，2004，4 (12):3665-3685.
[14]张跃，王正祥，吴练中，等. 阴道毛滴虫致病株可溶性抗原的电泳分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(4):296-299.