作者：陈俊，董海艳，朱珊丽，欧琴，张丽芳
【摘要】 目的 ：了解温州地方株HPV16 L1基因结构特点，分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化，为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法：设计HPV16型L1基因特异性引物，从宫颈癌组织标本提取DNA，进行PCR扩增鉴定，PCR产物直接测序；进一步用Vector NTI 8.0和DNAStar软件分析HPV16型L1基因多态性及蛋白特性变化情况。结果：测定的序列与标准基因序列(NC 001526)比较，温州地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为99.1%～99.8%，分别形成8种突变模式，其中3处由于核苷酸的改变，翻译的氨基酸也相应发生变化，但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上与标准株相比较无明显变化。结论：温州地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异。
【关键词】 人乳头瘤病毒；宫颈癌；L1基因；突变；基因多态性
Abstract: Objective: To study the character of HPV L1 gene from Wenzhou area，and analyze changes of its polymorphism and protein property. Methods: The tissue DNA was extracted from cervical carcinoma. The L1 gene of HPV was amplified with PCR by 16 type specific primers， respectively. And L1 PCR products were identified by sequencing. At last， L1 gene polymorphism and protein property were analyzed with bio-soft of Vector NTI 8.0 and DNAStar. Results: Compared with standard L1 gene sequence (NC 001526)， gene homology was 99.1%～99.8% and eight mutations were found in HPV16 type，three of these mutations produced protein variations because of amino acids changed， but differences of their proteins were not found in hydrophilicity、surface probability and antigenic index compared with the standard L1 protein property. Conclusion: The results show that some mutation had taken place in the nucleotide sequence of L 1 gene of HPV 16 obtained from the cervical carcinoma tissues in Wenzhou area.
Key words: human papillomavirus；cervical carcinoma；L1 gene；mutation；gene polymor-phism
人乳头瘤病毒（HPV）16型是高危型HPV之一，与宫颈癌的发生有关[1]，约50%的宫颈癌患者肿瘤组织的DNA中检测到该型别[2]，因此，预防HPV感染对防治宫颈癌有重大意义。但HPV16在与不同遗传背景的宿主相互作用往往会引起病毒的变异，影响HPV感染和转归，了解HPV16多态性将为明确宫颈癌的发生和运用免疫学策略预防HPV16相关疾病提供新的思路。为了解温州地区宫颈癌患者HPV16 L1基因结构特点和变异规律，我们从宫颈癌组织DNA中扩增L1 基因片段，并进行克隆和测序分析，为疫苗研制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 标本
11份宫颈癌组织标本来源于温州医学院附属第二医院妇产科就诊的患者， 均经临床和病理诊断确诊为宫颈癌。每份标本均无菌切取病变组织(约2 cm×2 cm)，-80 ℃保存备用。
1.2 主要试剂
PCR试剂、λDNA/Hind III DNA marker购于上海晶美生物工程有限公司，动物组织DNA提取浓缩试剂盒购于大连TaKaRa公司，PCR清洁试剂盒购于杭州维特洁生化技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标本DNA的提取及PCR引物的设计：按试剂盒说明书操作提取宫颈癌组织标本DNA。以GENEBANK中报道的HPV16(收录号为NC 001526 )L1基因序列为标准序列，共设计4条引物(见表1)，分别用于PCR扩增L1完整开放读码框和基因序列测定。由北京三博生物技术有限公司合成。
1.3.2 HPV L1基因扩增及型别鉴定：以标本DNA为模板，用HPV16型特异性引物行PCR扩增。扩增参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3.3 HPV L1基因序列测定及蛋白特性分析：PCR产物经PCR清洁试剂盒纯化，由杭州华大基因研究中心用特异性引物进行L1基因全长序列测定。与GENEBANK中的HPV16序列(NC 001526)进行比较，用Vector NTI 8.0和DNAStar软件对测序结果进行序列分析。
2 结果
2.1 HPV16型特异性引物PCR扩增检测结果
PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，可见一约1 600 bp的扩增条带。11份标本中HPV16 L1型DNA阳性率为54.5%(6/11)。
2.2 HPV16 L1基因全长序列测定及同源性分析
组织标本中分离的6株HPV16 L1核苷酸序列经测序后，用DNAStar进行同源性分析（见图2），显示其与标准株有99.1%～99.8%的同源性。用Vector NTI 8.0软件分析基因多态性(见表2)，HPV16型L1基因分别形成8种突变模式，HPV16型L1基因第5786(1/6)、5957(2/6)、6343(1/6)、6432(6/6)、7061(5/6)和7115(1/6)位发生点突变。在第6432位发生的突变，是突变的主流型。此外，在第6901与6903之间，所有标本的L1序列中均插入了ATC3个核苷酸，而标准株（NC 001526）中第6954至6956之间的3个核苷酸GAT，在所有标本的L1中缺失。
2.3 HPV16 L1蛋白氨基酸一级结构分析 与标准氨基酸序列比较，
用DNAstar软件进行L1蛋白氨基酸变异分析。结果显示，各标本分别存在1～3处点突变现象，其中所有的标本L1基因在第6432处碱基均发生突变，其编码的氨基酸由T→A，称为地方株，其余为同义突变。此外所有组织标本的L1在第6901与6903之间，因为插入了CAT 3个核苷酸而出现丝氨酸(S)，标准株（NC 001526）L1第6954至6956之间的GAT编码天门冬氨酸(D)，在组织标本的L1中缺失。
2.4 地方株HPV16 L1蛋白亲水性、表面可及性和抗原性分析
用DNAstar软件对地方株HPV16 L1蛋白进行分析，并与标准株比对进行分析。地方株L1蛋白在亲水性上无任何改变，氨基酸序列第295～300肽段抗原性减弱，第470～475肽段抗原性和表面可及性均减弱（见图3）。
3 讨论
L1基因是乳头瘤病毒晚期结构蛋白基因，在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中自发组装形成病毒样颗粒(VLPs)，其折叠形成的结构与天然病毒颗粒结构相同，具有较强的抗原性和免疫原性，可刺激机体B细胞产生中和抗体，从而阻断病毒感染，因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原。
研究证实，不同地域间HPV L1基因存在变异现象[3]，Ortiz等人报道了西班牙宫颈癌组织HPV16 L1基因存在8处变异，其中只在6695因为核苷酸的突变导致氨基酸由T→P，其余均为同义变异[4]。Pande等[5]人发现了印度北部地区宫颈癌组织HPV16 L1基因存在多处变异，其中有4处新变异，其中第6906和第6924处因核苷酸变异使得氨基酸分别从S→P以及G→P。国内研究发现扬州地区宫颈癌组织检测的HPV16 L1基因存在7处变异，与德国标准株比较在6903与6905间，地方株插入了CAT 3个核苷酸（丝氨酸，S），而在6954至6956间缺失了GAT（天门冬氨酸，D）[6]；与本文研究结果相一致。新疆地区宫颈癌患者以HPV16感染为主（占84.21%），其L1基因序列存在6种突变，在6901与6903间也插入了CAT（S），6949～6951处缺失了GAT（D）[7]；北京地区的鲍温氏病组织分离的HPV16，同样在其L1碱基序列中，第6901～6903处插入一个CAT，而在6949～6951处缺失了GAT[8]。
为了解温州地区HPV16 L1 的基本情况，我们设计了跨越HPV16 L1全长基因的一对特异引物，从宫颈癌组织中提取的DNA中克隆出HPV16 L1基因，经过序列测定，与网上公布的标准株（NC 001526）进行比对，发现温州地方株L1基因序列变异存在8处，其中3处由于核苷酸的改变，其编码氨基酸也发生相应变化，另5处核苷酸的改变多位于密码子第3位，且为同义突变，故未影响氨基酸的改变。
结果提示温州地方株HPV16 L1基因与标准株之间的差异，特别是氨基酸的改变，可能会造成HPV16 L1蛋白免疫原性的差异。实验结果为研制适应本地区的基于HPV16 L1的基因工程疫苗提供理论依据。
参考文献
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[4]Ortiz M， Torres M， Munoz L， et al.Oncogenic HumanPapillomavirus (HPV) Type Distribution and HPV Type 16E6 Variants in Two Spanish Population Groups with Differ-ent Levels of HPV Infection Risk [J]. J Clin Microbiol， 2006，44(4):1428-1434.
[5]Pande S，Jain N，Prusty BK， et al. Human Papillomavirus Type16 Variant Analysis of E6， E7， and L1 Genes and LongControl Region in Biopsy Samples from Cervical CancerPatients in North India[J].J Clin Microbiol， 2008，46(3):1060-1066.
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