【摘要】 目的 ：探索一种快速制备X染色体短串联重复序列(short tandem repeat，STR)基因座等位基因分型标准物的简便方法。方法 ：采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)切胶回收-二次PCR-测序的方法制备X-STR基因座等位基因分型标准物。结果：应用此法制备出大量的DXS9898基因座等位基因分型标准物。结论：利用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序制备STR基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法。
【关键词】 聚丙烯酰胺凝胶电泳;切胶回收;DXS9898基因座;等位基因分型标准物
X染色体的STR广泛分布于真核基因组中，高度稳定且有高度多态性， X-STR的最大应用价值就在于可以解决一些特殊的亲子鉴定案[1]，如单亲父女的亲权鉴定，缺乏双亲认定姐妹亲权关系。X-STR不仅在法医学中有其独特的应用价值，而且是进行X连锁遗传病基因诊断和基因定位的重要方法，对于人类学研究也有重要意义。X-STR基因座的基因型检测需经扩增、与等位基因分型标准物同步电泳才可获得正确的基因型。我们将PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶回收PCR产物、再次扩增及直接测序结合起来，探索了一种简单、快速制备DXS9898基因座等位基因分型标准物的方法。
1 材料和方法
1.1 DNA样品 174名汉族无关女性个体的血液样本来自温州地区，系本实验室日常检案积累。血液样本采用EDTANa2抗凝，Chelex-100快速法[2]提取DNA。
1.2 方法
1.2.1 首次PCR扩增：DXS9898基因座的引物序列参照基因组数据库(www.gdb.org)，由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增条件为94 ℃变性3 min，然后94 ℃变性35 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循环35次后，72 ℃保持5 min，于4 ℃保存。扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，银染显色[3]。
1.2.2 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段：在凝胶尚未完全干燥时用手术刀片切取含有目的条带的凝胶，要使切下的凝胶尽可能的细，用小镊子将其移入0.5 mL的离心管内，加20μL TE，用小镊子将凝胶夹碎，放入湿盒内，置于60 ℃ 恒温干燥箱中过夜后，将管子放入PCR仪中95 ℃ 变性10 min，短暂离心后取上清液2μL作为再次PCR扩增的模板。注意切取不同条带时要将刀片和小镊子尽可能地清洗干净，防止DNA交叉污染。
1.2.3 再次PCR扩增和序列测定：用上述DNA模板，使用原引物，建立20μL PCR反应体系，按第1次PCR条件完成35个循环。产物纯化后，委托上海盛兆生物科技有限公司用双脱氧终止法在ABI公司的3730测序仪上测定序列。
2 结果
2.1 首次PCR的PAGE电泳结果 在174名温州汉族无关女性个体中，DXS9898基因座共检出5个等位基因，其多态性片段长度范围为193～214 bp。挑选含不同等位基因的5个汉族个体的PCR扩增产物与pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker同步电泳(见图1)。
2.2 切胶回收与再次PCR结果 分别切胶回收DXS9898基因座各等位基因(见图2)，并以回收DNA为模板再次PCR，结果见图3。
2.3 再次PCR产物直接测序结果 取DXS9898基因座两个等位基因直接测序，测序结果按照重复单位的重复次数命名为等位基因8.3和等位基因11(见图4)。
3 讨论
目前，PCR-STR分型技术已成为国内外物证鉴定的主流技术，按照国际DNA委员会的要求，STR基因座的片段长度等位基因命名应有等位基因分型标准物作为参照，按重复单位的重复次数命名等位基因和基因型。因此，找到一种简便易行的方法制备一套精确的、国际标准化命名的标准参照物是非常必要的。
X染色体STR基因座作为常染色体和线粒体等多态性标记的重要补充，对X染色体的STR基因座分型结果作出正确地判定和命名，X-STR数据才能在个各实验室之间进行交流和合作。制备X染色体STR基因座等位基因分型标准物，目前经常采取的方法有两种:一是混合不同等位基因的扩增产物，再对各等位基因进行测序[4-5]，该法的缺点是不适合大量生产，一旦含有罕见等位基因的模板DNA用完，很难调配出等位基因分型标准物。二是用克隆技术制备等位基因分型标准物[6]，克隆方法在克隆成功后，可以通过培养细菌来大量制备等位基因，对保留罕见等位基因比较方便，但因其需要克隆和细菌培养，操作较复杂，对技术和环境要求也较高。而本方法所使用的仪器设备简单，结果明确，重复性好，可以获得经典克隆测序一样的确切序列，而避免了克隆的复杂后续过程，且第一次、第二次PCR和测序过程中用的都是统一引物，不需要再合成新的引物，所以该方法可供一般实验室广泛使用，但对其的准确性和稳定性的研究目前尚处在摸索阶段。
参考文献
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