作者：巴彩凤，李久纯，冯会权，赵微
【摘要】 目的 建立一种新型的猪附红细胞体病PCR诊断方法。方法 根据猪附红细胞体部分CDS基因序列（AJ504999）设计引物，建立一种新的猪附红细胞体病PCR诊断方法。通过实验室染毒实验，建立感染猪附红细胞体病的小鼠模型，并应用研制的PCR方法进行实验室验证。应用建立的PCR诊断方法对辽宁5个城市的385个猪样本进行猪附红细胞体病流行病学情况调查，确定猪附红细胞体病的感染率。结果 成功建立猪附红细胞体病PCR诊断方法，通过染毒模型验证了该方法具有快速、特异性强、敏感性高的特点。并估计出辽宁省猪群中附红细胞体总体感染率95%的可信区间为（82.50%，89.44%）。结论 本研究建立的猪附红细胞体病PCR诊断方法及临床应用，为辽宁地区乃至全国附红细胞体病的防治工作提供了科学理论数据。
【关键词】 猪附红细胞体病 PCR 动物模型 感染率
Abstract: Objective To establish a new PCR diagnostic method of mycoplasma suis(M.suis) .Methods The primers were designed based on the partial CDS gene sequences(GenBank nos AJ504999) to establish a new PCR diagnostic method. A mouse model was established through the toxicity test in the lab and the lab test was conducted using the PCR method. The epidemiology situation of M. suis of 385 porcine blood samples in Liaoning Province was investigated using the CPR diagnostic method. Results It showed that the PCR diagnostic method was established successfully and it has been tested that this method was rapid， specific and highly sensitive . In this study， we find that the prevalence rate of M. suis infection varied from 82.50% to 89.44% in province. Conclusions The study showed that the PCR diagnostic method and its clinical application of M. suis provided the scientific theory data for the prevention and cure of M.suis in Liaoning Province even the whole nation.
Key words:mycoplasma suis; polymerase chain reaction; animal model; infectionrate
附红细胞体是一种专性血液寄生生物，寄生于多种动物和人红细胞表面、血浆及骨髓内，引起一种以溶血性贫血、黄疸、发热等为主要临床症状的人兽共患传染病［1］。近几年，猪附红细胞体病流行给中国的养猪业带来很大的损失。同时，对人类健康也构成了严重威胁。但是，目前缺乏附红细胞体的体外培养体系，严重地限制了其生物学系统分析和有效诊断方法的研究［2］。
传统的猪附红细胞体病的临床诊断主要基于光镜检查和血清学方法［3］，但特异性差，敏感性低，并存在一定的误诊，难以反映动物感染的真实情况。本实验在传统诊断方法的基础上建立一种新的猪附红细胞体病PCR诊断方法，实验室内通过动物模型验证其具有快速、特异性和敏感性。将该方法应用于辽宁省各大猪场的猪附红细胞体病流行病学调查研究，获得了可靠的研究数据。
1 实验材料
1.1 样本来源 患病猪血样采自锦州某猪场，病猪为已确诊猪附红细胞体病，并排除其他病原体感染。流行病学调查样本来自于锦州市（35个）、凌海市（100个）、丹东市（100个）、铁岭市（100个）、大连市（50个）5个城市的385个随机抽查的猪样本。实验血样均经颈静脉采血，用柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝（ACD与血液抗凝比例为1∶5），4℃冰箱保存。
1.2 实验动物 健康昆明小鼠20 只由辽宁医学院实验动物中心提供。患病猪来自锦州某猪场。
1.3 主要试剂 DH5a感受态细胞、pMD18-T载体、DNA Marker 100bp、限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、蛋白酶K、 Taq DNA聚合酶等（TAKARA公司）；凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（AxyPrep公司）。
2 实验方法
2.1 猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立
2.1.1 猪附红细胞体基因组提取 传统的酚-氯仿方法提取猪附红细胞体基因组DNA，电泳及核酸定量仪测定其完整性及浓度，-20℃保存备用。
2.1.2 引物设计与合成 根据2003年Hoelzle等提供的猪附红细胞体部分CDS基因序列（AJ504999）设计引物，利用Oligo6.0和Primer5.0设计了一对引物F1（正向引物）：5' CAGCGGTGAGAAAGCAAG 3'F2 (反向引物)： 5' GGTGCCCTTGCTGTCTCA 3'扩增区域为ORF6－ORF9部分基因。引物序列由上海生工合成。
2.1.3 最佳退火温度的选择及PCR扩增 对临床20份猪血液样本分别进行镜检（血液压片、姬姆萨染色涂片）后，选用含有猪血液基因组的重组质粒（本实验室自备）作为DNA模板，根据不同退火温度下目的条带的电泳亮度及特异性试验的结果综合分析，确定该反应体系的最适退火温度。PCR扩增程序：预变性95 ℃ 5 min；（变性94 ℃ 40 sec，退火54.4 ℃ 50 sec，延伸72 ℃ 50 sec）×35循环；终末延伸72 ℃，10 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带回收纯化，经T-A克隆筛选后测序。
2.1.4 PCR的特异性及敏感性检测 以猪附红细胞体为试验样本，猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、弓形虫、牛巴贝斯虫基因组DNA作为对照样本，按照最适退火温度进行PCR扩增。以重组质粒为模板，核酸蛋白定量仪测定其浓度，并进行倍比稀释，按照最佳条件进行PCR扩增，确定PCR方法的敏感性。
2.2 实验室内PCR诊断方法的验证——猪附红细胞体小鼠感染模型的建立
2.2.1 实验动物分组与处理 健康昆明小鼠20 只，尾尖采血，进行鲜血压片和吖啶橙染色镜检，确定小鼠无附红细胞体感染后随机分为实验组和对照组。实验组小鼠预先注射地塞米松（每只0.1 mg，隔日1 次）；并腹腔注射阳性的病猪新鲜血液样本，每只0.5 mL /d，直至试验结束。对照组注射等量生理盐水。
2.2.2 显微镜检及PCR检测 从人工感染后的第1天起，每天从各组小鼠尾尖采血200 μL，一部分用于鲜血压片镜检，另一部分用于PCR检测。根据镜检结果分析猪附红细胞体的感染情况。
2.2.3 小鼠感染模型的病理解剖学及形态学观察 每天观察感染小鼠状况，包括体温、精神状态、皮肤毛发、粘膜颜色、饮食、饮水、排尿排便情况等。在注射感染样本后的第3 周，对小鼠进行剖检，肉眼观察各主要脏器病变。取心、肝、脾、肺、肾、小肠、淋巴结等器官，用10％中性福尔马林固定，做成石蜡切片，HE染色后用显微镜观察并拍照，详细描述观察到的病理改变，并记录。
2.3 猪附红细胞体病PCR诊断方法的应用——辽宁地区猪附红细胞体流行病学调查 随机抽查了5个城市，385个猪样样本，各样本分别用鲜血压片法、Wrights-Giemsa染色和吖啶橙荧光染色三种方法进行光镜镜检。观察M.suis感染红细胞后引起红细胞形态的变化、描述在活体状态以及两种染色标本中M.suis感染红细胞的形态特点。对血液样本进行DNA提取，通过本研究建立的PCR技术检测附红细胞体感染率。
3 实验结果
3.1 猪附红细胞体的光镜学检查结果 感染附红细胞体病猪的临床光镜学检查结果见图1所示，鲜血涂片(图1A)在油镜下观察可见猪附红细胞体呈球形、卵圆形、短杆状等多形态，呈淡绿色荧光，红细胞出现不同程度的变形，红细胞表面有多个突起，有的呈现针芒状或星芒状。姬姆萨染色涂片检查(图1B)，油镜下可见红细胞表面有附红细胞体附着，数量较少，同时可见90％以上的细胞发生变形，出现锯齿形和棘形。吖啶橙染色(图1C)涂片可见感染附红细胞体的红细胞表面或边缘可见到亮绿色的荧光点，大小不一。生理盐水涂片(图1D)直接镜检，可见M.suis附着在红细胞表面，引起细胞膜不规则变形。G-W染色(图1E)可见M.suis附着在红细胞表面呈蓝紫色。并在血清中检测到游离的M.suis（图1F）。
3.2 猪附红细胞体PCR扩增方法的建立 温度梯度PCR确认最适的退火温度为54.4℃。PCR扩增结果得到与预期片段相同的特异性扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测得到单一的扩增条带，条带明显清晰，经GeneTools软件分析及测序获得602bp的目的片段 (图2)。将测序结果与Genbank中已知的各种微生物进行相似性搜索表明，测序结果与GenBank中发表的猪附红细胞体序列（AJ504999）同源性达一致。
3.3 PCR诊断方法的特异性及敏感性检测结果 按照最适退火温度进行PCR扩增时，结果显示只有猪附红细胞体扩增出了602bp的特异性条带，而猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、弓形虫、牛巴贝斯虫均无特异性条带，说明该方法有较好的特异性(图3)。获得的含有猪附红细胞体的重组质粒OD260/280=1.860，说明无蛋白质和RNA污染。浓度为143.0 mg/L，连续经1×101稀释、1×103稀释、 1×105稀释、1×107稀释、1×109稀释、1×1011稀释倍比稀释后进行PCR扩增，结果表明能检测到的最小DNA量为0.143fg（图4）。
3.4 临床样品的检测 对临床20 份猪血液样本经血液压片镜检和姬姆萨染色涂片镜检，12 份阳性，8 份阴性；而PCR检测结果显示14 份阳性（包括3份镜检阴性的血样），其它阴性（包括3份镜检阳性），对3 份镜检阴性而PCR检测阳性血样经重复扩增仍为阳性。
3.5 猪附红细胞体病小鼠感染模型的检测
3.5.1 PCR方法检测 小鼠在人工感染猪附红细胞体后的第2天，用 PCR诊断方法在实验组小鼠的血液样本中检测出了602bp的特异性条带，对照组小鼠由始到终结果为阴性。而实验组小鼠在感染后的第2天，在镜下才见到红细胞的变形。
3.5.2 小鼠病理学检查结果 腹腔注射感染样本后，实验组小鼠相继出现食欲减退、精神沉郁、体重不增、被毛粗乱等临床症状，对照组小鼠未见异常。感染后第3周，将实验组小鼠剖检后可见各主要脏器均受累，表现为：血液稀薄，胸腔、腹腔积液，肺肿胀、充血水肿，心肌松软，肝肿大、质地变脆，胆囊膨大，脾脏肿大、出血，胃内有积食。病理组织学病变见图5所示。
3.6 辽宁地区猪群中附红细胞体流行病学调查结果 利用本研究建立的PCR诊断方法对辽宁省猪群的385个猪样本进行PCR检测，部分样本检测出602bp的阳性条带，阳性检出率较高。PCR检测总样本感染率见表1所示。利用正态分布理论，根据总样本感染率估计出辽宁省猪群中M.suis总体感染率95%的可信区间为（82.50%，89.44%）。
表1 辽宁省猪群中M.suis感染率统计（略）
4 讨论
4.1 猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立 1993年Gwaltney S M 等［4］首次用PCR方法对附红细胞体感染的猪血样进行了扩增，随后Messick 等根据M.suis 的保守序列16SrRNA 基因设计了3对引物，建立了定量竞争PCR方法，但是由于16SrRNA 基因与其他病原微生物的16SrRNA 基因有高度的同源性，因此基于16SrRNA设计引物的PCR方法特异性不高，容易造成假阳性结果。2005年张浩吉等［5］基于16S rRNA基因设计引物建立的PCR检测方法血液抽提基因组DNA最低检测量160pg。
目前，国内尚未见到基于猪附红细胞体基因组序列建立PCR的诊断方法。本实验基于Hoelzle最新报道的猪附红细胞体部分基因组序列（AJ504999）设计引物，成功扩增出猪附红细胞体602bp基因片段，建立的PCR诊断方法对重组质粒最低检测量为0.143fg，相当于血液基因组DNA的143pg，敏感度更低于前述两位学者的DNA最低检测量。此序列经GenBank比对后没有与之相近的序列，这样就避免了与猪附红细胞体相近的病原体的非特异扩增，使PCR诊断方法更具有特异性，本研究对与猪附红细胞体发生混合感染或临床症状易混淆的其他病原基因组DNA 进行了对照扩增试验，均呈阴性结果，有力地说明该方法有较高的特异性。同时PCR方法高效、快速、准确，最重要的是它灵活且易于操作，在临床检测中可以得到有效的应用。
4.2 猪附红细胞体病小鼠模型的建立及检测 近几年，国内外学者都在试图找到一种合适的动物模型来深入研究附红细胞体病。国外用切除脾的猪进行人工感染试验，但此方法不适合群体诊断；用SPF级仔猪作为感染动物，但SPF猪难以获得。考虑到昆明小鼠是常用的实验动物，饲养方便，价格便宜，可以用来复制附红细胞体感染。本实验将昆明小鼠预先注射地塞米松，降低其免疫力，经腹腔人工接种猪附红细胞体，成功地构建了感染猪附红细胞体病的小鼠模型。利用本研究建立的PCR诊断方法对模型小鼠进行检测，扩增结果为阳性。而模型小鼠在PCR诊断后第二天才在镜下观察到红细胞表面有附红细胞体的附着。镜检结果比PCR晚2天，证明了本实验室建立的PCR方法确实具有较高的灵敏性和特异性。对于小鼠体内的猪附红细胞体具有早期诊断的意义。本研究在国内首次对猪附红细胞体感染小鼠模型的病理形态学进行研究，国内外尚未见报道。
4.3 辽宁省猪附红细胞体病流行病学调查 本实验采用实验室内建立的PCR诊断方法对辽宁省5个城市随机抽查的385头猪进行了流行病学调查，通过对M.suis特异DNA序列的扩增，能检测到血液中微量的M.suis，是国内首次利用分子生物学技术对辽宁地区养殖猪群中M.suis感染进行的普查。此方法对M.suis检测有高度特异性和敏感性，在无临床表现感染的检测中具有显著优越性，同时弥补了光镜检测M.suis感染主观性强、染色条件不易统一等局限性，为M.suis的特异性检测和大规模普查提供了一个简便有效的检测方法。
此次调查结果显示被调查的五个城市中M.suis的隐性感染率均达到70%以上，总样本隐性感染率为85.97%，估算辽宁省总体感染率亦达到80%以上，这些数据表明M.suis的感染在辽宁地区猪群中是广泛存在的。更值得注意的是，五个城市中所有被调查对象没有一例出现附红细胞体病的临床症状，这一现象表明上述广泛存在的M.suis感染均为隐性感染。根据临床症状来发现和诊断M.suis感染存在局限性，而本研究建立的PCR诊断方法具有更高的敏感性，对于附红细胞体的临床诊断具有重要意义。如果能利用本研究建立的PCR诊断方法在混合感染的猪病中进行附红细胞体病的筛选诊断，能够大大降低混合感染猪群治疗药物的投入成本，从而提高病猪的治愈率，降低发病率和死亡率。这将给辽宁地区乃至全国附红细胞体病的防治提供了科学理论数据，除此之外，本研究的方法还可以应用于人、狐等其他动物的附红细胞体病的诊断，这为人兽共患附红细胞体病的防治作出了应有的贡献。
（此文图1－5见附页4－5）（略）
参考文献
［1］ Messick JB， Walker PG， Raphael W，et al. 'Candidatus mycoplasma haemodidelphidis' sp. nov.， 'Candidatus mycoplasma haemolamae' sp. nov. and Mycoplasma haemocanis comb. nov.， haemotrophic parasites from a naturally infected opossum (Didelphis virginiana)， alpaca (Lama pacos) and dog (Canis familiaris): phylogenetic and secondary structural relatedness of their 16S rRNA genes to other mycoplasmas ［J］. Int J Syst Evol Microbiol， 2002， 52(3):693-698.
［2］ Messick JB. Hemotrophic mycoplasmas (hemoplasmas): a review and new insights into pathogenic potential［J］. Vet Clin Pathol， 2004;33(1):2-13.
［3］ Neimark H， Johansson KE， Rikihisa Y， et al . Revision of haemotrophic Mycoplasma species names［J］. Int J Syst Evol Microbiol，2002， 52（2):683 .
［4］ Gwaltney SM ， Hays MP ， Oberst RD. Detection of Eperythrozoon suis using the polymerase chain reaction［J］.JVet Diagn Invest ，1993 ，5 (1) :40-46.
［5］ 张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用［J］.中国兽医学报，2005，25(5):480-483.