【摘要】 目的 研究甘草次酸衍生物（甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷，Gal-GAOSt）修饰去甲斑蝥素脂质体(Gal-GAOStNC-LP)在小鼠体内的分布及肝靶向性。方法 利用薄膜分散法制备甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体后，经小鼠尾静脉给药，采用HPLC法检测去甲斑蝥素在小鼠肝肾中的浓度随时间的变化，与去甲斑蝥素水溶液组进行比较，并以靶向指数TI=（AUC）NC-SOL/（AUC）Gal-GAOStNC-LP来判断Gal-GAOStNC-LP对主要器官的靶向性。结果 Gal-GAOStNC-LP组在肝脏中组织浓度明显高于NC-SOL组，肝的靶向指数大于1，而肾的靶向指数小于1。结论 甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体具有肝靶向性，能提高药物疗效，降低毒副作用。
【关键词】 甘草次酸；去甲斑蝥素；脂质体；靶向性；组织分布
Abstract：Objective To study the distribution and liver targeting of glycyrrhetinic acid derivatives (stearin glycyrrhetinic acid ester-3-O-galactosidase， Gal-GAOSt) modifying norcantharidin liposomes (Gal-GAOStNC-LP) in rats. Methods Making use of film decentralization to prepare glycyrrhetinic acid derivatives modifying norcantharidin liposomes， and then injecting it to the tail vein of rats. Making use of HPLC to detect the change of norcantharidin concentration in the rats’ liver and kidney over time and compared it with norcantharidin solution group and targeting index TI = (AUC) NC-SOL / (AUC) Gal-GAOStNC-LP to determine the targeting of Gal-GAOStNC-LP to the main organs. Results Organization concentration of Gal-GAOStNC-LP group in the liver was significantly higher than NC-SOL group， the liver targeting index was greater than 1， and the targeting index of the kidney was less than 1. Conclusions Glycyrrhetinic acid derivatives modifying norcantharidin liposomes possess liver targeting that can improve the efficacy of drugs， reduce toxicity and side effect.
Key words:glycyrrheticacid;norcantharidin;liposome;targeting;distribution
去甲斑蝥素具有抗癌，保护肝细胞和调节免疫等作用［1］，可用于肝癌等恶性肿瘤的治疗，是一种具有潜力的抗肿瘤中药，但是其毒性很大容易对机体产生不良反应。本实验制备的甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体（Gal-GAOStNC-LP）可望改变去甲斑蝥素在体内的分布情况，呈现肝靶向性，降低不良反应。为了考察Gal-GAOStNC-LP的肝脏靶向性，采用反相液相色谱法测定去甲斑蝥素在脏器组织中的含量表证组织分布状况，在预实验及相关文献发现NC在心脾肺中分布浓度非常低，依据本实验目的故只对肝肾进行考察，通过对Gal-GAOStNC-LP组和去甲斑蝥素水溶液组（NC-SOL）两组的小鼠进行位静脉注射给药，测定不同时间小鼠肝肾中去甲斑蝥素的浓度并结合靶向指数分析评价靶向性。
1 实验材料和仪器
1.1 药品与试剂
去甲斑蝥素对照品：北京万辉双鹤药业，纯度为准99.5%，批号991206；大豆磷脂酰胆碱：上海金伴药业有限公司，批号20020904；胆固醇：天津东方试剂厂，进口分装；葡聚糖凝胶G-100：上海化学试剂厂，进口分装；甲醇：天津康科德化学试剂厂（色谱纯）；磷酸：北京化工厂（分析纯）；硫酸：天津市泰兴试剂厂；氯仿、乙腈等其它试剂均为分析纯，水为双蒸镏水，0.45μm膜过滤；PBS缓冲液（phosphate buffered saline）：137 mmol NaCl，2.6 mmol KCl，3.2 mmol Na2HPO4，1.6 mmol Kh3PO4，pH=7.02。
1.2 仪器
福立高效液相色谱仪：浙江温岭福立分析仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海安亭电子仪器厂；JY96-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪：宁波新芝科学仪器研究所；TD型电子天平：德国赛多利斯股份公司；PSH-3C型酸度计：上海伟业仪器厂；0.45和0.22 μｍ微孔滤膜：大连依利特科学仪器有限公司 ；100 μｍ微量加样器：上海亚荣仪器厂；KQ-100超声波清洗器：昆山市超声波仪器厂；HH-S恒温水浴锅：江苏医疗仪器厂。
1.3 实验动物
Sprague-Dawley(SD)小鼠，雌雄兼用，体重（20±2）g，由辽宁医学院实验动物中心提供。
2 实验方法与结果
2.1 液相色谱条件
色谱柱 ：Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液—甲醇（80∶20），用磷酸调节pH值到3.1；流速：0.6 mL/min；柱温：24℃；紫外检测波长∶210 nm；进样量：20 μL。
2.2 去甲斑蝥素脂质体及甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体的制备
2.2.1 脂质体处方
大豆磷脂酰胆碱：150 mg；胆固醇：50 mg；去氧胆酸钠： 15 mg；去甲斑蝥素：10 mg；甘草次酸衍生物：20 mg。
2.2.2 制备方法［2，3］
精密称取一定量去甲斑蝥素，注射用大豆卵磷脂，胆固醇，去氧胆酸钠，Gal-GAOSt，溶于适量的氯仿，置于500 mL茄形瓶中，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，得到透明均匀的脂质薄膜。加入一定量PBS，继续用旋转蒸发仪水化一定时间，得到带淡蓝色乳光的GA脂质体，依次过0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，在上葡聚糖凝胶G50柱，以PBS洗脱分离得到脂质体，于4 ℃下保存备用。
2.3 组织分布研究
2.3.1 小鼠给药方法
取小鼠44 只，2 只作为空白对照，处死后剖腹，取出肝、肾组织。其余42只随机分成a，b两组，即去甲斑蝥素水溶液组（NC组）、甘草次酸衍生物修饰脂质体组（Gal-GAOStNCLP组）。给于相当于去甲斑蝥素20 mg/kg药物制剂，a组为NC组，b组为Gal-GAOStNCLP组，给药后分别于1/6、1/3、0.5、1、2、4、6 h各取3 只小鼠处死，剖腹取出肝、肾组织，用生理盐水漂洗残留血，滤纸吸干水分备用。
2.3.2 组织样品处理［4］
精密称定每一脏器组织的重量，按每1 g脏器加入生理盐水1 mL进行匀浆，匀浆液于超声波细胞粉碎仪超声5 min（3 000 w），3 000 r/min离心10 min，取上清为组织匀浆液。取组织匀浆液置离心管中，加入2倍体积的乙腈，于旋涡振荡器上旋涡5 min，3 000 r/min离心10 min，分层后取上清，进行液相色谱测定。
2.4 方法学研究［5］
2.4.1 测定方法的专属性考察
取静脉推注20 mg/kg甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体2 h的小鼠组织匀浆，按“组织样品处理”项下方法处理并分析，见图1在选定的色谱条件下，小鼠组织匀浆中的内源性物质不影响去甲斑蝥素的测定。
2.4.2 标准曲线的制备
在空白肝肾组织匀浆1 mL中分别精密加入去甲斑蝥素适量，配制一系列浓度样品溶液，按“组织样品处理”项下操作，采用液相色谱测定去甲斑蝥素的浓度。以峰面积A对浓度C进行线形回归，得NC在肝肾组织匀浆中的标准曲线。按照精密度及回收率配制高中低3 种不同浓度的各组织样品液，各平行操作5 次，按样品预处理与测定方法进行操作，测定回收率、日内和日间RSD值。见表1。 表1 去甲斑蝥素在肝肾组织中的标准曲线、线形范围、相关系数、回收率、日内和日间精密度组织标准曲线线形范围μg/mLr回收率%日内RSD%日间RSD%肝＾Y=12.0316C-2.6831.0 ～800.996899.073.513.78肾＾Y=9.7021C-2.72491.0 ～800.988497.893.583.45
由表可知，本色谱方法在线性范围内去甲斑蝥素的方法回收率介于95%～100%之间，日内精密度小于5%，日间精密度小于10%，符合生物样品分析方法的基本要求。表2 NC-SOL和Gal-GAOStNC-LP在不同组织中的AUC和靶向指数
3 讨 论
由图2和3可以看出，修饰组在所考察的时间点的肝脏药物浓度均明显高于溶液组，肾脏组织药物浓度则明显下降，这表明被修饰的脂质体靶向性明显。本实验用靶向指数来定量说明Gal-GAOStNC-LP的肝靶向性。靶向指数（TI）常用于衡量靶向制剂的靶向性。其定义为：靶向制剂治疗组小鼠器官中AUC与普通制剂治疗组小鼠器官中AUC的比值，如果TI值大于1，则表明该靶向制剂对该器官具有靶向作用，如果TI值小于1，则说明该靶向制剂没有靶向作用。本实验通过DAS2.0版的药动软件对各组织的靶向参数进行计算，由表2 可见Gal-GAOStNC-LP 对肝的靶向参数大于1，TI值为5.2135，具有十分明显的靶向作用，而对于肾则无靶向作用。由此得出结论Gal-GAOSt是具有肝靶向性的靶向材料。为进一步的肝脏靶向研究提供依据。对于Gal-GAOSt导向分子在脂质体表面上嵌入部分及方式和体内代谢机制等考察需要后续的实验进一步的研究。（此文图1-3见附页1）
参考文献
［1］ Liu XH，Blazsek I，Breard J， et al .Elliptinium，norcantharidin and tetrachlordecaoxide incombined chemoimmunotherapy prolong the survival of friend-virus-infected mice［J］.Drugs Exp Clin Res，1991，12:419.
［2］ Sung Hee Hwang，Yoshie Maitani.Remote loading of diclofenac，insulin and fluorescein isothiocyanate labeled insulin into liposomes by pH and acetate gradient methods［J］.International Journal of Pharmaceutics，1999，176:85-95.
［3］ Stephane Clerc，Yechezkel Barenholz. Loading of amphipathic weak acids into liposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1995，1240:257-265.
［4］ 姜华，郭伟英.RP-HPLC法测定去甲斑蝥素钠脂质体包封率［J］.锦州医学院学报，2006，27（6）：62-63.
［5］ 吴建梅，任天池.去甲斑蝥素脂质体的制备方法及理化性质研究［J］.中国药学杂志，2005，40（19）：1485-1489.