作者：谷燕娇 苏荣健， 高志安
【摘要】 目的 探讨分子伴侣Grp78用于胸部良恶性肿瘤鉴别诊断的可能性。方法 应用免疫印迹技术对36例疑似肺癌病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平进行检测，并将检测结果与胸水脱落细胞学检查结果和临床病理资料对照。结果 免疫印迹结果表明Grp78高表达的21例病人，经过临床观察和病理学检查，有19例被临床诊断为肺癌，Grp78表达水平较低15例病人中，没有病例被诊断为肺癌，灵敏度为90%，特异度为85.7%；而应用传统的检测方法对36例肺癌疑似病人胸水进行脱落细胞学检查，有12例病人怀疑为肺癌，经过临床及病理学检查有4例被排除，灵敏度为47%，特异度为85%。结论 检测肺癌疑似病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平可以提高肺癌鉴别诊断的灵敏度，有利于胸部恶性肿瘤的早期诊断及鉴别诊断。
【关键词】 Grp78；胸部肿瘤；鉴别诊断
Abstract：Objective To explore the possibility of detecting Grp78 expression levels in the hydrothorax detached cells in the differential diagnosis in chest tumors. Methods The expression levels of Grp78 in 36 cases of suspended chest tumor patients were detected by western blot and the hydrothorax detached cells analyses were also detected by HE staining. Results In the 21 cases of patients that Grp78 is overexpressed in the hydrothorax detached cells， 19 cases of patients were identified as lung cancer by retrospective analysis of clinicopathological data. In the 15 cases of patients that Grp78 was radically expressed， none of which was diagnosed as cancer. In the 12 cases of patients diagnosed as lung cancer by the hydrothorax detached cells analysis by HE staining， 4 cases were excluded from the diagnosis of cancer based on clinicopathological analysis. The sensitivity of HE staining is 47% compared with 81% of western blot. The specificity of HE staining and western blot is 85% and 85.7% respectively.Conclusions Detection of Grp78 expression levels in the hydrothorax detached cells is a useful target in the differential diagnosis of chest tumor.
Key words：Grp78; chest tumor; differential diagnosis
肺癌发病率高预后较差是一种严重威胁人类健康的疾病，其早期发现对于肺癌病人的治疗及预后具有重要意义。胸水脱落细胞学检查是早期诊断肺癌的一种常用方法，但是传统的脱落细胞学检查过多依赖于操作者的业务能力，主观性较强，而且灵敏度低，在一定程度上延误了肺癌的诊断，因此，提高检测的灵敏度和客观性是非常必要的［1］。
Grp（glucose regulated protein）78是内质网合成的分子伴侣，在内质网中与新生蛋白质和错误折叠的或非折叠蛋白质结合，帮助其折叠形成正确的构象。近年来的研究表明，Grp78的表达与功能与肿瘤的发生、进展关系密切，在正常细胞中低/不表达，在恶性肿瘤细胞中高表达［2-5］。在分化程度不同的细胞中Grp78表达的水平不同，在分化程度低的细胞中其表达水平较高而在分化程度高的细胞中其表达水平较低［6］。本研究，对36例肺癌疑似病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平进行检测，以探讨胸水脱落细胞中Grp78表达作为肺癌鉴别诊断的一个辅助指标的可能性。
1 材料与方法
1.1 样品
36例肺癌疑似病人的胸水均来者本钢胸科医院肿瘤科，32例胸膜炎病人的胸水均来自本钢胸科医院结核内科。
1.2 样品的处理
将胸水5 000 g离心3 min，收集细胞，PBS漂洗3次，向沉淀中加入500 μL RIPA 缓冲液，混匀，置于冰上作用30 min，12 000g离心10 min，将上清移入一个干净的EP管中。另取少量沉淀涂片，3.7%多聚甲醛固定，HE染色进行形态学检查。
1.3 蛋白质定量
取细胞裂解液2 μL加入去离子水3 μL，考马斯亮蓝3 mL，标准管加入蛋白标准液2 μL代替细胞裂解液。对照管用2 μL RIPA缓冲液代替细胞裂解液，应用分光光度计与575 nm读取吸光度值，计算细胞裂解液中蛋白质浓度。蛋白质浓度＝（A测定－A对照／A标准－A对照）×标准液蛋白质浓度。
1.4 Western Blot
取相当50 μg蛋白质的细胞裂解液上样于10％的SDS-PAGE，电泳至溴酚蓝出胶，然后将蛋白质转印的用甲醇浸透的PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜，然后加入一抗（山羊抗小鼠Grp78IgG，山羊抗小鼠Actin IgG）杂交2 h，二抗杂交1 h，ECL显色。用凝胶分析系统测定Grp78和Actin的灰度值，并计算二者比值，作为Grp78表达的相对量。
1.5 统计学分析
应用 t检验对炎性胸水和癌性胸水中Grp78表达水平进行比较；应用2检验比较两种检查方法的灵敏度及特异性。
2 结 果
2.1 WB检测
应用Western Blot技术分别检测癌性胸水及炎性胸水脱落细胞中Grp78的表达水平，结果发现癌性胸水中Grp78的表达量明显高于炎性胸水，这表明胸腔积液脱落细胞中Grp78表达水平可用于癌性胸水与炎性胸水的鉴别诊断。上图为Grp78的表达情况，下图为actin的表达情况
图1 WB检测癌性胸水及炎性胸水中
脱落细胞的Grp78的表达水平
表1 癌性胸水与炎性胸水中Grp78表达水平分组n±stP癌性胸水361.46±0.21炎性胸水320.89±0.2410.36＜0.01
经统计学t检验分析表明，癌性胸水脱落细胞中中Grp78表达水平明显高于炎性胸水。
2.2 两种方法对肺癌的鉴别诊断
与传统的脱落细胞学检查方法相比，应用Western Blot技术分别检测癌性胸水中Grp78的表达水平可以提高胸水脱落细胞学检查的灵敏度，这些进一步证明胸腔积液脱落细胞中Grp78表达水平可用于癌性胸水与炎性胸水的鉴别诊断。
如表2所示，在36例肺癌疑似病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平进行检测，结果发现其中21例Grp78表达水平较高，15例表达水平较低。在Grp78高表达的病例中有19例被临床确诊为肺癌，灵敏度为90%。特异度为85.7%。应用传统的形态学检查36例肺癌疑似病人胸水脱落细胞，有12例被诊断为肺癌，其中8例临床确诊为肺癌，灵敏度为42%，特异度为85%，经统计学χ2检验分析新方法的灵敏度明显高于形态学检查，特异度没有差别。
表2 两种方法进行肺癌鉴别诊断的结果对比阳性例数阴性例数形态学检查12（8）24（28）检测Grp78表达水平21（19）15（17）
3 讨 论
肺癌在我国发病率以及病死率高，严重威胁人们的生命，胸水是肺癌的一个重要临床表现［7］，因此，胸水脱落细胞学检查是肺癌的诊断与鉴别诊断的一个重要环节。但传统的脱落细胞学检查过多依赖于操作者的业务能力，灵敏度低，尤其难以区分肺癌和炎性增生，因此，提高检测的灵敏度和客观性是非常必要的。
Grp（glucose regulated protein）78是内质网合成的分子伴侣，近年来的研究表明，在分化程度不同的细胞中Grp78表达的水平不同，在分化程度低的细胞中其表达水平较高而在分化程度高的细胞中其表达水平较低［6］544-551。本研究36例肺癌疑似病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平进行检测，以期明确Grp78作为肺癌早期诊断的一个客观指标的可能性。
我们的研究表明，癌性胸水脱落细胞中Grp78的表达水平明显高于炎性胸水。与形态学检查相比，应用Western Blot技术检测胸水中Grp78表达水平应用于肺癌的诊断和鉴别诊断灵敏度高，特异性差别不大。这些表明，胸水脱落细胞中Grp78表达水平是反映细胞增殖程度的一个指标，可以应用于肺癌的诊断与鉴别诊断。
参考文献
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