三氧化二砷协同柔红霉素对K562/A02细胞株的作用

　　　　 作者：王珂，丁家华，吴玮玮，陈宝安，顾炎，袁鹏

【摘要】 　　目的： 研究三氧化二砷(As2O3)及柔红霉素（DNR）联合应用后对人白血病耐药细胞株K562/A02的作用，探讨其应用于临床的可能性。方法： 采用MTT比色法测定单用DNR及DNR与不同浓度As2O3合用时的生长抑制效果，用流式细胞术检测胞内DNR浓度及凋亡。结果： DNR对K562/A02细胞的半数抑制浓度（IC50）为15.4 mg/L，加用0.25，0.5，1.0 μmol/L As2O3时的IC50分别为1.73，0.78，1.42 mg/L。1 mg/L DNR作用于K562/A02 48 h后的凋亡率为(17.4±2.19)%，0.5 μmol/L As2O3作用于K562/A02 48 h后的凋亡率为(53.8±5.6)%，而两药合用后凋亡率为(65.5±6.2)%，但合用后胞内DNR浓度并未增加。结论： 低浓度的As2O3与DNR联合应用对K562/A02细胞的抑制为协同作用，其效应与增加药物的诱导凋亡作用有关，而非通过增加胞内DNR浓度。

【关键词】 药物疗法； 联合； 多药耐药； 三氧化二砷； 柔红霉素

　　［Abstract］Objective: To explore the cytotoxity of combination of arsenic trioxide and daunorubicin on multidrug resistance of cell line K562/A02， and study the feasibility of combination of two drugs in clinical drug therapy.Methods： MTT assay were used to measure the growth inhibitory effect of DNR with or without various concentration of As2O3. The intracellular concentration of DNR and apoptotic changes were observed by flow cytometry. Results： The IC50 of DNR on K562/A02 cells was 15.4 mg/L. The IC50 of DNR combined with 0.25，0.5，1.0 μmol/L As2O3 on K562/A02 cells were 1.73，0.78，1.42 mg/L respectively. The apoptosis percentage of treating K562/A02 cells with DNR 1 mg/L，As2O3 0.5 μmol/L and both for 48 hours were（17.4±2.19）%，（53.8±5.6）% and （65.5±6.2）%. But the intracellular concentration of DNR didn′t raise after combination of two drugs. Conclusion： As2O3 can present a synergistic effect with DNR on K562/A02 cells.The main mechanism may attribute to induction of apoptosis but not increasing the intracellular DNR content.

　　［Key words］drug therapy; combination; multidrug resistance; arsenic trioxide; daunorubicin

　　白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，在儿童肿瘤发病中占50%以上。目前，化疗仍为白血病治疗的有效手段，尽管不断有新的化疗药物和化疗方案推出，但肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药是化疗失败的主要原因，至今仍为肿瘤治疗的一大难题。目前临床用来克服耐药的手段主要有两个：①尽量选择患者敏感的药物，加大化疗药物剂量；②应用耐药逆转剂联合化疗以克服耐药。前者是应用比较普遍的方法，但疗效不理想，患者往往因出现各种严重的并发症而死亡，因此寻找合适的联合化疗方案受到了越来越多的关注。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）是一种与巯基（-SH）有高度亲和力的原浆毒，已成功应用于治疗急性早幼粒细胞白血病， 对其他类型的白血病及多种实体瘤也有效。国内外研究表明，As2O3对一些耐药细胞株仍有诱导凋亡［1-3］及逆转耐药［4］的作用。柔红霉素（daunorubicin，DNR）是一种蒽环类抗肿瘤药，是一种目前广泛运用于血液系统肿瘤和各种实体瘤的化疗药，为细胞周期非特异性药物，对G2期作用尤其显著。我们用MTT法检测了As2O3及DNR对白血病多药耐药细胞株K562/A02的细胞毒性，并通过流式细胞仪检测了凋亡，进一步探讨了As2O3与化疗药物组成联合化疗方案治疗耐药白血病的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系及培养

　　敏感株K562及其多药耐药（MDR）株K562/A02由中国医学科学院血液学研究所提供。两种细胞均接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃，5% CO２饱和湿度培养箱中，2～3天传代1次。K562/A02细胞维持增殖的多柔比星终浓度为1 mg/L，实验前无药培养2周。

　　1.2 试剂

　　噻唑蓝（MTT，Sigma公司），RPMI1640培养液、小牛血清（Gibco公司），柔红霉素（DNR，Farmitalia公司），亚砷酸注射液（As2O3，哈尔滨伊达药业有限公司）。

　　1.3 MTT法检测不同浓度As2O3及DNR合用时的生长抑制作用

　　取对数生长期的K562及K562/A02细胞以2×105/个细胞悬液160 μl，分别加入浓度为2.5及50 mg/L的DNR，倍比稀释8个浓度，每个浓度梯度的培养体系中加入As2O3使其终浓度为0.25，0.5，1.0 μmol/L，每个浓度设3个平行孔，另设不加细胞、不加As2O3及不加DNR的对照组，生理盐水调节每孔终体积为200 μl，。置37℃，5% CO２饱和湿度培养箱中培养48 h后取出，加5 g/L MTT反应液20 μl，继续培养4 h，于平板离心机上3 000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加150 μl DMSO溶解，微量振荡器上混匀，酶标仪上测定540 nm的光密度值D，计算细胞的生长抑制率：
生长抑制率=1-实验孔D值对照孔D值×100%

　　IC50为细胞生长抑制率为50%时的药物浓度。

　　1.4 流式细胞仪检测凋亡率
　　
　　实验分组如下：A组为空白对照组，B组为DNR组，C组为As2O3组，D组为DNR+As2O3组（其中DNR终浓度为1 mg/L，As2O3终浓度为0.5 μmol/L）。孵育48 h后收集细胞，用4℃预冷的PBS洗涤2次，用1 ml blot 缓冲液重悬细胞，各加入10 μl Annexin VFITC，常温避光15 min后洗涤细胞，重悬后检测。检测前仪器需调节补偿。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞内DNR浓度

　　根据蒽环类药物可自发荧光的特性（488 nm激发光下发红光）可检测胞内DNR浓度。取对数生长期细胞按前述条件分组处理48 h后收获细胞，用冷PBS洗涤2次，1 ml PBS重悬后上样。

　　1.6 确定药物联合作用的方式

　　根据文献［5］，假定有两种药物的生长抑制率分别为A和B，且A＞B。依据最大化模型，两药联合作用时预期的生长抑制率C应等于A。若C＜A，两药为拮抗作用；若C＞1-(1-A)×(1-B)，两药为协同作用；若C介于这两者之间为相加作用。

　　1.7 统计学处理

　　IC50采用线性回归法处理，统计数据用±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行t检验和方差分析。

　　2 结果

　　2.1 两药合用时的MTT结果

　　不同浓度的DNR与As2O3合用后的细胞生长抑制率与单用DNR时比较，除DNR浓度为50 mg/L组外，其余差异均有统计学意义（表1），K562/A02中加入0.25，0.5，1.0 μmol/L As2O3后其DNR IC50值由15.4 mg/L变为1.73，0.78，1.42 mg/L，耐药逆转倍数达8.9，19.7，10.8（表2）。表1 DNR联合不同浓度As2O3对K562/A02的生长抑制率（略）表2 DNR联合不同浓度As2O3对K562/A02的IC50值及耐药逆转倍数（略）
　　
　　根据MTT结果选择DNR浓度为1 mg/L，As2O3浓度为0.5 μmol/L作为下一步实验研究的浓度。单加0.5 μmol/L As2O3后的细胞生长抑制率为（46.8±2.0）%，单加1 mg/L DNR后的细胞生长抑制率为（23.8±3.8）%，两药合用后的细胞生长抑制率为（71.2±2.9）%，为协同作用。

　　2.2 Annexin V检测细胞凋亡

　　单加DNR组的凋亡百分比为（17.4±2.19）%，单加As2O3组的凋亡百分比为（53.8±5.6）%，两药合用后的凋亡百分比为（65.5±6.2）%（图1）。
　　
　　2.3 流式细胞仪检测细胞内DNR浓度

　　以K562加1 mg/L DNR后胞内的荧光强度为参照，未与As2O3合用时K562/A02胞内的荧光强度为K562的（45.6±3.2）%，而加As2O3后胞内的荧光强度为K562细胞的（29.5±2.1）%，胞内的DNR浓度未增加。

　　3 讨论

　　As2O3已证实对急性早幼粒细胞白血病（APL）有良好的促凋亡作用，临床应用于APL也取得了较为满意的疗效［6］。实验室研究表明，As2O3对其他血液系统肿瘤、实体瘤及多种耐药细胞仍有诱导凋亡的作用，但所需浓度较高［7］，在低浓度时它可诱导肿瘤细胞发生部分分化［8］。As2O3体内药代动力学表明，0.1% As2O3注射液10 ml一次给药后体内浓度8～10 h&>1 μmol/L ［9］。能否将临床易达到的低浓度As2O3与化疗药联合治疗多药耐药白血病，对此我们进行了研究。
　　
　　我们的实验观察了≤1 μmol/L As2O3与DNR合用时对K562/A02细胞的细胞毒作用，发现两药合用后能明显增强对多药耐药细胞株的细胞毒性，在0.5 μmol/L时的耐药逆转倍数达19.7，且As2O3在较低浓度时即可与DNR呈协同效应，随着浓度的升高，其协同效应逐渐减弱。推测其原因可能有：①As2O3并非P糖蛋白的作用底物［1］，在MDR时As2O3仍可进入胞内发挥作用。②降低GST的表达，抑制GST的活性，与还原型谷胱甘肽(rGSH)的巯基相结合，降低胞内rGSH的浓度，从而增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［10］。③As2O3与化疗药作用的细胞周期不同，As2O3可使细胞周期阻滞于G1/S或G2/M［11，12］，DNR为细胞周期非特异性药物，对各期细胞均有杀伤作用，但对G2期作用更显著。

　　肿瘤的多药耐药是目前化疗失败的原因，其机制主要有膜糖蛋白介导的药物外排泵机制，如P糖蛋白，多药耐药相关蛋白，肺耐药相关蛋白等；酶介导机制，如谷胱甘肽S转移酶、DNA拓扑异构酶等；凋亡调控基因及抗凋亡蛋白的高表达等［13，14］。本实验研究显示，As2O3与DNR合用时对耐药细胞具有协同作用机制可能是通过增加耐药细胞的凋亡而非通过增加胞内化疗药物浓度来实现的，因此，我们下一步的实验应着重研究两药合用时肿瘤细胞凋亡调控基因及抗凋亡蛋白变化、耐药相关基因及蛋白的变化等，为临床联合用药提供可靠的理论基础。

　　总之，As2O3能抑制耐药细胞的生长，协同增强化疗药DNR的细胞毒性，可组成新的联合化疗方案治疗耐药白血病，且使用的药物浓度低，毒副作用少，具有较广阔的临床应用前景。

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