两种方式制备的原核表达含TAT蛋白转导域融合蛋白穿膜能力比较

　　 作者：许逊，蔺昕，田雨香，招倩倩，季宝菊，刘静，夏圣，王胜军，许化溪，邵启祥

【摘要】 　　目的： 联合应用多种技术评价不同方式制备的TAT转导结构域eGFP目的蛋白的穿膜效率及亚细胞定位情况，以期建立有效、稳定的高效穿膜蛋白制备方法。方法： 诱导表达、纯化包涵体形式融合蛋白，分别进行直接脱盐和透析复性，并与细胞共育，然后通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹法评价融合蛋白穿膜能力。结果： 通过透析复性制备的融合蛋白穿膜效率极低；而纯化后直接脱盐的融合蛋白经流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹等方法分析，表明均具有高效穿膜能力。结论： 两种方式制备的融合蛋白均能穿膜，但透析复性制备的蛋白穿膜效率低，且不易定位于细胞核中，影响进一步对该目的蛋白在胞核中生物学行为的研究；而脱盐的变性蛋白具有高效的穿膜效率。

【关键词】 转导结构域； 透析； 复性； 包涵体； 穿膜效率

　　［Abstract］Objective: To evaluate the efficacy and subcellular localization of the fusion protein eGFPinterest protein including protein transduction domain of TAT by multitechnology and to obtain the more effective cellular uptake protein for the further research of its biological function.Methods： Induced the Expression of fusion protein， and extracted and purified it from the inclusion bodies. Jurkat cells exposure to fusion protein which was directly desalted and refolded via dialysis， respectively. Flow cytometry analysis， confocal microscope observation and Western blot detection were used to evaluate the efficacy of the fusion protein to transduce into the cell cytoplasm. Results： The results of the detected by flow cytometry， confocal microscope and Western blot indicated that the fusion protein which desalted by PD10 column could penetrate Jurkat cells more efficiently， contrasty， the renaturated protein via dialysis had low activity. Conclusion： Both of the fusion proteins treated with two different methods could translocate through the cell membranes，but the dialyzed fusion protein had low efficiency and didn′t locate into cell nucleus， would disbennifit for the following research work about the biologic activity and behavior of the fusion protein on transcriptional level.

　　［Key words］protein transduction domain; dialysis; refolding; inclusion bodies; efficacy of transduce through the cells membrance

　　通过细胞穿透肽进行蛋白转导是体外蛋白传递的一种有效方法。最常用的蛋白转导肽就是HIVTAT基因的第一个外显子编码的第48～56位氨基酸残基，其具有核定位和蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）［1，2］。Green等［3］和Frankel等［4］早先发现胞外的HIVTAT能够穿过胞膜进入细胞到达胞核。此后对TAT蛋白的体内外进一步研究发现了其中第48～56位中的9～11个氨基酸残基是蛋白转导的关键区域，该区域能转导自身及与其融合蛋白进入细胞。在体外只要将TAT融合蛋白直接添加到细胞培养介质中即可起效［5-8］。PTD的穿透原理未完全明确，目前认为PTD可能由乙酰肝素硫酸脂蛋白聚糖（HSPG）介导的内摄作用进入细胞［9，10］。大肠埃希菌表达的PTD融合蛋白产物通常存在于不可溶的包涵体中。包涵体中蛋白需要经过变性剂溶解和复性才能得到有活性的蛋白质［11，12］。复性是蛋白质从未折叠到折叠形式的过程，受到众多因素的影响，包括变性剂对包涵体的溶解度、变性剂的去除、一些小分子对复性的帮助等等［12， 13］。我们在研究中发现复性的带PTD的融合蛋白穿膜效率远远低于我们预期的效率，本文对PTD融合蛋白在不同处理条件下的穿膜效率进行了对比研究。
　　
　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　pET28aPTDeGFP目的蛋白原核表达载体由我室构建，工程菌E.Coli DH5α，Rosetta(DE3)，BL21，Jurkat E6.1 T细胞为我室保存，纯化树脂 Profinity I MAC镍金属螯合填料（美国BioRad公司产品），鼠抗-6×HisTag单克隆抗体(Cell Signaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒，PD10脱盐预装柱(美国GE公司)，蛋白复性试剂盒（Novagen公司产品），蛋白分子量标准（Fermentas公司产品)，还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG Dioxane Free）（德国Merck公司产品），碘化丙啶（PI）（Sigma公司产品），透析袋(截留相对分子质量10 000， 美国Pierce公司），小牛血清（杭州四季青公司），PRMI 1640培养基(Invitrogen公司)，其余试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2 仪器
　　Nikon激光共聚焦显微镜，XL2020型超声波破碎仪，FASCaliber以及CellQuest软件（美国BD公司）

　　1.3 方法

　　1.3.1 PTDeGFP目的蛋白融合蛋白的诱导表达及纯化

　　将我室保存测序正确的pET28aPTDeGFP目的基因质粒分别转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)和BL21，筛选出阳性克隆及最适表达菌，平板上挑单个菌落至3 ml LB 培养基（含50 μg/ml卡那霉素3 μl），37℃摇床培养过夜后以1∶100的比例将菌液接种于200 ml LB培养基，37℃增菌培养至D(600 nm)=0.4～0.6时加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG，于30℃诱导8 h。4℃12 000×g离心10 min，弃上清，1/10体积的预冷PBS重悬细菌，加入100 μg/ml的溶菌酶，冰浴，300 W超声12 s间隔15 s共8个循环超声裂解菌。4℃12 000×g离心20 min，分别取上清和沉淀行SDSPAGE电泳分析。用 6×HisTag纯化柱Ni2+IMAC对融合蛋白进行纯化（按BioRad公司操作说明书进行），即在pH8.0环境中用50 mmol/L Nah3PO4，300 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素结合缓冲液溶解包涵体，50 mmol/L Nah3PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素洗涤缓冲液去除杂蛋白，然后再用50 mmol/L Nah3PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素洗脱液洗脱融合蛋白。

　　1.3.2 两种方式制备PTDeGFP目的蛋白融合蛋白

　　①变性状态纯化后脱盐:Ni2+IMAC纯化后的蛋白过GE公司PD10预装柱脱盐及尿素。②变性状态纯化后透析复性［14，15］:参照Novegen蛋白复性试剂盒说明，纯化包涵体蛋白后，配透析复性液：尿素 （6，4，3，2，1，0.5和0 mol /L），20 mmol /L Tris·HCl，1 mmol /L EDTA，100 mmol /L NaCl，0.25% NP40，调整pH至8.0，在4℃冷库中按前述尿素浓度梯度依次分别透析12 h，最后将透析袋置于RPMI1640培养液中透析。透析后过PD10柱。以上两种方式制备蛋白均用SDSPAGE检测蛋白纯度，蛋白质印迹检测蛋白的特异性。-20℃保存于10%甘油溶液中备用，用时Bradford 法定量融合蛋白。

　　1.3.3 细胞培养及穿膜效应的流式细胞仪检测

　　Jurkat E6.1 T细胞，常规培养于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L链霉素的RPMI1640培养液。以2×105/孔细胞浓度种于24孔板，与不同浓度（0，320 ，640 nmol/L）的PTDeGFP目的蛋白共育1 h。 1 000×g离心10 min分别收集各孔细胞用PBS洗3次，FASCaliber流式细胞仪收集以及CellQuest软件分析。

　　1.3.4 激光共聚焦显微镜观测穿膜蛋白在细胞内的定位

　　1.5 ml EP管收集与蛋白共育的细胞（2×105个/管），1 000×g离心10 min。预冷PBS洗2遍，1 000×g离心5 min。加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定30 min。离心去固定液，用PBS洗2遍，洗涤期间手动晃动。加入PI染色液（终浓度50 μg/ml）缓缓悬起细胞，4℃避光染色30 min，PBS洗涤。加25 μl PBS重悬细胞并滴加至载玻片上，盖上洁净的盖玻片，指甲油封片。共聚焦显微镜下使用绿色滤光片检测呈红色荧光的细胞核，使用蓝色滤光片检测融合蛋白中eGFP绿色荧光。

　　1.3.5 胞质和胞核蛋白提取及免疫印迹检测

　　1 000×g离心10 min收集与蛋白共育的细胞，用4℃预冷的PBS洗3遍，加400 μl冷缓冲液A（10 mmol/L HEPEs，10 mmmol/L KCl，0.1 mmmol/L EDTA，0.1 mmmol/L EGTA，0.5 mmmol/L PMSF，pH7.9），冰浴10 min；加25 μl 10%NP40，Vortex 10 s，冰浴10 min，12 000×g离心15 s，收集上清，即为胞质蛋白；加50 μl冷缓冲液B（20 mmmol/L HEPEs，0.4 mmol/L NaCl，1 mmmol/L EDTA，1 mmmol/L EGTA，1 mmmol/L PMSF，1 mmmol/L DTT，pH7.9）至沉淀，置冰上30 min；12 000×g离心10 min，收集上清，即为胞核蛋白；加等量的2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，-80℃冻存备用。提取的胞浆胞核蛋白用12% SDSPAGE胶分离；350 mA 2h将蛋白转印至PVDF膜；用5%脱脂牛奶(溶解于TBS/T液)封闭1 h；加抗6×HisTag(1∶1 000)，4℃过夜，用TBS/T洗涤3次；加HRP羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，室温1 h，TBS/T洗涤3次；加ECLPlus化学发光剂，作用5 min，扫膜，拍照；一抗二抗剥脱液洗膜5～10 min，封闭1 h，4℃过夜孵育抗GAPDH抗体（1∶1 000），TBS/T洗涤，HRP羊抗小鼠IgG(1∶5 000) 室温静置1 h，TBS/T洗涤后ECLPlus显色，扫描检测GAPDH内参蛋白。

　　2 结果

　　2.1 融合蛋白PTDeGFP目的蛋白诱导表达、纯化和复性
　　
　　将重组质粒pET28aPTD目的蛋白分别转化E.coli Rosetta(DE3)及BL21菌株经SDSPAGE分析选取最佳诱导条件：转化E.coli Rosetta(DE3)菌，以终浓度为0.2 mmmol/L的IPTG诱导8 h，蛋白条带位于80 kDa处与预期相符(图1a)。各取超声裂解产物上清和沉淀行SDSPAGE电泳可见：目的蛋白主要以包涵体形式存在(图1b)。使用Histag纯化柱Ni2+IMAC在变性条件下对融合蛋白进行纯化，取1/2通过Novagen蛋白复性试剂盒梯度透析复性并脱盐，SDSPAGE显示复性后的蛋白与复性前所取总菌体蛋白位置一致(图1c)，透析过程中未出现明显沉淀（图1d）。剩余1/2纯化的融合蛋白通过PD10脱盐柱脱去尿素及盐（图1e）。

　　2.2 透析复性及直接脱盐的PTDeGFP目的蛋白穿膜能力的流式细胞仪分析

　　两种方式制备的融合蛋白分别与Jurkat E6.1T细胞共育1 h后，收集细胞，经流式细胞仪检测结果显示：变性状态下纯化直接脱盐的融合蛋白PTDeGFP目的蛋白约70%～80%进入Jurkat E6.1T细胞，且随浓度增加穿膜效率增高，而经试剂盒透析复性后的蛋白穿膜能力弱，结果仅30%左右(图2a)。采用直方图分析结果同散点图，且提示在这约30%穿入细胞的透析复性的蛋白中，有一部分表现为强荧光低平峰（图2b 箭头所指）。

　　2.3 激光共聚焦显微镜对比透析复性及直接脱盐的PTDeGFP目的蛋白穿膜能力

　　在荧光显微镜下观察到透析复性的蛋白在与Jurkat E6.1T细胞共育时，蛋白（eGFP）的荧光呈云雾状分布（图3a左），而变性状态下纯化直接脱盐的蛋白（eGFP）的荧光呈均匀近圆形点状分布（图3a右）。激光共聚焦显微镜下观察发现：与变性PTDeGFP目的蛋白共育的Jurkat E6.1T细胞约70%有蛋白穿入，并且融合蛋白除可在细胞质发现外，在细胞核中亦有分布（图3b），而与透析复性蛋白共育的细胞，仅约10%的细胞与变性蛋白观测情况一致，其余可检测到绿色荧光的细胞经多荧光叠加及3D旋转和断层扫描分析，发现是绿色荧光融合蛋白黏附或嵌入于细胞膜表面所致，而未进入细胞内（图3c）。
　　
　　2.4 蛋白质印迹鉴定穿入细胞的透析复性及直接脱盐的PTDeGFP目的蛋白

　　分别收集与两种方式制备的融合蛋白共育1 h的Jurkat E6.1T细胞，提取各自相应的胞质、胞核蛋白。经蛋白免疫印迹显示变性状态下纯化的蛋白共育的细胞胞质、胞核提取物，均可见80 kDa处有较浓条带，而加入透析复性蛋白的细胞提取物，仅胞质提取物中有较浅条带，而胞核中未见明显的阳性带（图4）。
　　
　　3 讨论

　　E.coli表达系统是目前基因工程中最常用的外源蛋白表达系统，其遗传背景清楚，操作简便，易培养，成本低，且拥有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。但许多外源基因常常以不溶、无活性、疏水性强和沉淀的包涵体形式聚集于菌体内。包涵体具有高密度，且其中约50%以上是目的蛋白，易于分离纯化。另外，包涵体形式也有效抵御了E.coli中蛋白酶对目的蛋白的降解［11］。传统的技术为获得活性蛋白，先用变性剂溶解包涵体，再通过缓慢去除变性剂（如透析）进行复性。包涵体是聚集和正确折叠竞争后趋向于聚集的产物，新生肽的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠速率，就会导致包涵体形成［12，16］。本研究应用镍柱亲和纯化变性状态下的融合蛋白，然后分别用透析复性和直接脱盐制备PTD融合蛋白，最后进行穿膜实验，比较两者穿膜效率。PTD融合蛋白的穿膜效率从一定程度上反映了体外透析复性蛋白的稳定性，及制备PTD融合蛋白方法的有效性。
　　
　　穿膜效率的检测常用方法有流式细胞术检测及荧光显微镜观察，但由于涉及融合蛋白与细胞共育后再检测，复性的蛋白不稳定会导致聚集黏附于细胞表面，造成流式细胞检测的穿膜假阳性结果。这种假阳性结果，依据流式细胞术的散点图及直方图的图形无法正确判断，但在荧光显微镜或共聚焦显微镜下可直接观察。因而联合应用两种方法来检测穿膜蛋白的内化，可以有效避免假阳性结果。对于包涵体形式表达的穿膜蛋白而言，其穿膜前的处理对于其穿膜能力、效率有着较为明显的影响。两种方法比较，将制备的融合蛋白溶于变性剂（8 mol/L脲），在变性状态下亲和纯化，而后使用脱盐柱脱去尿素所获得的蛋白，在与细胞的共育体系中相对比较稳定，聚集沉淀较少。在流式散点图上通过设门圈出的阳性细胞群体分布均匀相对集中，荧光显微镜下观察穿膜效率较高。经过激光共聚焦显微镜及免疫印迹分析可证明该法制备的融合蛋白可高效穿过细胞膜进入细胞，且部分在PTD核定位信号的引导下进入细胞核中。而透析复性的PTD穿膜融合蛋白，由流式细胞图分析可见穿膜效率较低，荧光共聚焦观测则发现大部分细胞表面仅为蛋白紧密黏附而非真正的蛋白穿膜内化，免疫印迹下胞质提取物见较浅目的条带，胞核提取物中未见明显目的蛋白条带。因目的蛋白为核转录因子，功能发挥场所为细胞核内，较低的穿膜效率尤其是较弱的胞核定位能力，会使其无法发挥生物学功能。
　　
　　总之，制备穿膜融合蛋白需要综合考虑穿膜与功能发挥，而关键点在于穿膜能力，包括穿膜效率和亚细胞定位（依据目的蛋白作用场所不同而定）；研究穿膜能力的最终目的是发挥目的蛋白生物学功能。但有穿膜才可谈功能，穿膜是前提；有功能，无法穿膜或穿膜能力弱，则功能无法体现，因此要力求达到穿膜与功能的平衡。就两种方式制备的融合蛋白而言，透析复性法制备的蛋白大部分复性较完全，可能已具有生物学功能，但其空间构象使得PTD核定位区域甚至PTD全部被包裹或遮挡而另外一部分蛋白复性不完全疏水结构显露多，在细胞培养环境中倾向于聚集，故穿膜效率低，细胞核定位能力弱；经纯化后直接脱盐法制备的蛋白可能仍处于变性状态，PTD区域显露，故穿膜效率高，能定位于细胞核，有利于进一步的功能学实验研究。目前研究表明即使在变性状态下穿入细胞的融合蛋白仍可在细胞内的HSP90蛋白家族和细胞内环境的作用下复性并发挥其生物学功能［17］。鉴于蛋白性质差异，本实验中目的蛋白是否确实能发挥其功能有待后续实验证实，但综合考虑，应首选变性状态下纯化并直接脱盐的方法制备穿膜融合蛋白，从而获得较高的穿膜效率并可在PTD核定位信号的引导下穿入胞核为目的蛋白功能发挥提供场所。

　　（本文图3见彩色插图）

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