超声微泡造影剂介导血管生成素1基因治疗下肢缺血的实验观察

　　　　作者：陶政 徐三荣 刘文新 陈保定

【摘要】 目的： 探讨用超声微泡造影剂介导血管生成素1（Ang1）基因治疗兔下肢缺血的可行性。方法： 将15只大白兔左侧股动脉及其分支切断结扎后随机分成3组：介导组采用局部注射pEGFP/Ang1质粒与超声微泡造影剂的混合物并用超声照射；非介导组局部直接注射pEGFP/Ang1质粒；对照组注射生理盐水。治疗4周后进行血管造影，了解侧支循环和新生血管情况。结果： 在侧支循环建立和新生血管方面，介导组较多，非介导组其次，对照组较少。结论： 用超声微泡介导的Ang1基因转染，可促进缺血骨骼肌的血管新生和侧支循环建立，为下肢缺血性疾病的基因治疗提供了一种新的途径。

【关键词】 超声； 微泡造影剂； 血管生成素1； 基因治疗； 下肢缺血

　　［Abstract］ Objective: To investigate the feasibility of microbubble mediating Ang1 gene therapy lower limb ischemia by using ultrasound. Methods： Fifteen rabbits with the left femoral artery ligation were randomly and averagely devidied into 3 groups: the plasmid pEGFP/Ang1 and microbubble mixture local intramuscular injection plus ultrasound local radiation group(group A)，the plasmid pEGFP/Ang1 local intramuscular injection group(group B)，and the control group(group C). Four weeks posttreatment， angiography was applied to evaluate the collateral circulation， and new vascular. Results： In the collateral circulation and new vascular of the treatment region，group A was superior to the group B， the group B was superior to the group C. Conclusion： Microbubble mediating Ang1 gene therapy by using ultrasound could promote the collateral circulation and new vessels development， it will be a new method for the treatment of limb ischemic diseases.

　　［Key words］ ultrasound;microbubble; angiopoietin1; gene therapy; lower limb ischemia

　　下肢动脉狭窄闭塞引起的缺血性疾病是临床常见疾病，常通过人造血管旁路术或血管腔内治疗来改善下肢血供，但有时并不能达到改善肢体血流的目的。20世纪90年代以来，基因治疗技术发展迅速。新近发现血管生成素是一类特异性作用于血管内皮细胞的促血管生长因子，备受瞩目［1］。因此，我们通过实验来观察血管生成素1（angiopoietin1，Ang1）治疗动物肢体缺血的疗效，并进一步探讨超声微泡造影剂作为基因载体在治疗中所起的作用。

1 材料与方法

　　1.1 动物缺血模型的建立

　　健康新西兰大白兔15只（购自本校动物实验中心），体质量2.5～3 kg，随机分为3组，每组5只。耳缘静脉推注氯安酮，30 mg/kg，用8%的Na2S脱毛，仰卧并固定于操作台上，行左侧股动脉（腹股沟韧带上方）及其分支切断结扎，造成左下肢缺血模型。

　　1.2 超声照射仪器的参数设置

　　Sonosite超声诊断仪，发射频率为14 MHz，超声波机械指数为0.33，超声波的声强范围为0.2 W/cm2，聚焦深度2 cm，辐照时间为60 s。

　　1.3 微泡造影剂的准备

　　微泡造影剂由重庆医科大学超声影像学研究所研制，药品名利载显（脂质超声造影剂），造影剂浓度为（3.0～3.5）×109/ml，平均粒径约1 μm。

　　1.4 质粒的准备

　　质粒pEGFP/Ang1（由广州军区广州总医院医学实验科张宏斌博士惠赠），在感受态大肠埃希菌中扩增，经质粒大量抽提试剂盒（碧云天生物有限责任公司）大量提取，溶于双蒸水中，BioRad公司蛋白核酸检测仪（Smart spec3000型）检测其浓度为6 mg/ml。

　　1.5 质粒的转染

　　缺血模型明确（一般在手术后3天即可作出判断，标准：缺血的肢体肌力下降）后进行转染。介导组采用超声微泡造影剂和pEGFP/Ang1质粒的混合物（质粒1 ml+造影剂3 ml在4℃下混合2 h，使pEGFP/Ang1质粒黏附于微泡的外壳，质粒的浓度为1.5 mg/ml），肌注部位是股骨中点大腿内收肌，共5点，缓慢注射，注射深度1 cm，每点0.2 ml，注意观察，防止渗漏。用超声局部持续照射60 s；非介导组大腿内收肌单纯注射质粒，质粒的浓度为1.5 mg/ml，共5个点，每点0.2 ml；对照组在相同部位注射生理盐水。

　　1.6 动脉造影

　　动物饲养4周后，予腹壁切开，行腹主动脉插管造影，加压1秒注入76%泛影葡胺造影剂2 ml，在DSA机下观察侧支循环建立状况。

2 结 果

　　左下肢动脉造影结果显示：超声照射微泡造影剂+pEGFP/Ang1质粒组可见左下肢有较多的侧支循环和新生血管形成，部分侧支较粗；单纯注射质粒pEGFP/Ang1组可见左下肢有部分侧支循环建立，而对照组侧支循环建立则较少（见图1）。

3 讨 论

　　由于人口的老龄化， 下肢缺血性动脉疾病如动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等疾病的发病率逐年增加。目前治疗上可以通过人造血管旁路术或血管腔内治疗（如球囊扩张、支架植入等）等方法来达到恢复缺血肢体血流灌注的目的。但是，当血管闭塞严重时，则无法进行上述治疗，患者有面临截肢的可能。20 世纪 90年代以来，生物技术和基因技术的发展为下肢缺血的治疗提供了新的途径，人们开始尝试应用血管生长因子及其基因治疗方法来促进缺血组织的血管新生，从而达到治疗供血障碍的目的［2］。

　　目前在下肢缺血的基因治疗中，已经发现20多种相关的血管生成因子，其中研究最多的是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。研究证实VEGF在治疗周围缺血性疾病的过程中能促进侧支循环的增多。同时，人们又发现另一种特异性作用于血管内皮细胞的促血管生长因子家族［3］血管生成素（Ang）。目前已知Ang家族编码4种结构相似的蛋白质Ang1，Ang2，Ang3(小鼠)和Ang4，其中Ang1和血管生成关系密切。Ang1和血管内皮特异性的酪氨酸激酶型受体（Tie2）结合促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性并调节血管功能［4-5］。Thurston等［6］认为Ang1促血管形成可能另有其他机制：Ang1对血管内皮细胞（Ecs）有强力的特异性趋化及迁移作用，可诱导ECs的产生并维持血管网的稳定性。本组实验中，质粒pEGFP/Ang1转染动物后，新生血管和侧支循环的增多，前两组均较对照组多，说明Ang1在治疗下肢缺血疾病时能和VEGF一样起到增加侧支循环、改善下肢血供的目的。

　　基因治疗可采用蛋白制剂给药和基因转染两种方式。前者往往需要大量的产品，价格昂贵，给治疗带来很大不便。而后者提取方便，一次给药即可获得2～3周以上的持续表达。带有目的基因质粒转染的方法一般有局部注射、基因埋线、导管导入等［7］，在上述方法中肌肉注射最为简便。本组实验就采取带有目的基因质粒pEGFP/Ang1在兔大腿内收肌的局部多点注射，实验结果证明是有效可行的。

　　基因治疗效果往往取决于带有目的基因质粒的转染率。为提高基因的转染率，常需基因载体帮助。病毒是最常用的基因载体，其基因转染率高，但由于机体对病毒的免疫反应，限制了它的使用；而脂质体等非病毒基因载体的转染率又很低，静脉注射缺乏靶向性［8］，局部注射又有创伤等问题。因此，如何将目的基因安全、高效、靶向性地导入体内特定器官、组织并在靶细胞内表达是目前研究的重点。近几年来国内外研究发现，超声造影剂(ＵＣＡ)可作为一种新型的体内基因转染载体。ＵＣＡ大都为内含气体的微气泡，ＵＣＡ在超声波的作用下会不断地压缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡就会破裂，这样带有目的基因的质粒就释放到被超声波照射的局部组织中。Lawrie等［9］发现使用微泡造影剂联合超声辐射可使基因转染率提高3 000倍。同时国内张群霞等［10］研究发现超声微泡介导基因转染后能有良好的蛋白表达。本组实验中微泡造影剂+质粒组在超声照射后左下肢动脉造影显示侧支循环和新生血管的数量上都较后两组多，说明超声造影剂作为载体进行基因治疗有高效、安全的优点。

　　综上所述，本实验用超声微泡造影剂介导Ang1的方法较单纯注射质粒显著提高了缺血肢体的侧支循环和血管新生，这为促进外周缺血疾病的血管新生提供了一种简便高效的治疗方法。

参考文献

［1］ 张真真.血管生成素及其受体与肿瘤的血管生成［J］.国外医学:生理、病理科学与临床分册，2004，24(2):159-162.

［2］ 方 伟，郭曙光.血管内皮生长因子治疗下肢缺血性疾病的研究进展［J］.中国普通外科杂志，2006，15（12）：952-953.

［3］ Sellke FW， Ruel M. Vascular growth factors and angiogenesis in cardiac surgery［J］. Ann Thorac Surg，2003，75(7):S685-S690.

［4］ Stratmann A， Risau W， Plate KH，et al. Cell typespecific expression of angiopoietin1 and angiopoietin2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis［J］.Am J Pathol， 1998，153(8):1459-1466.

［5］ Suri C， McClain J， Thurston G， et al. Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin1［J］. Science， 1998，282(5388):468-471.

［6］ Thurston G， Suri C，Smith K，et al. Leakage resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angipoietin1［J］. Science，1999，286(11):2511-2514.

［7］ Baumgartner I， Pieczek A， Manor O，et al.Constiutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia［J］. Circulation，1998，97(12):1114-1123.

［8］ 景香香，王志刚. 超声微泡造影剂一种新型的基因载体［J］. 中国医学影像技术，2004，20（3）：359-361.

［9］ Lawrie A， Brisken AF， Francis SE， et al. Microbubbleenhanced ultrasound for vascular gene delivery［J］. Gene Therapy， 2000，7(23):2023-2027.

［10］ 张群霞，王志刚，冉海涛，等.超声微泡介导VEGF基因治疗下肢血管闭塞［J］.中国医学影像技术，2005，21（4）：507-509.