PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

　　 作者：蔺昕 宗扬勇 许逊 田雨香 陈勋 舒新军 夏圣 王胜军 许化溪 邵启祥

【摘要】 目的： 构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）、eGFP的小鼠Foxp3突变体（PTDeGFP△E250 mFoxp3）融合蛋白，为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础。方法： 利用重叠延伸PCR方法构建pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3原核表达载体，并在大肠埃希菌Rosetta (DE3)中表达此融合蛋白，经Ni2+柱纯化，通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率。结果： 成功构建了pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3原核表达载体，并表达和纯化了PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核。结论： 成功制备了具有穿膜活性的PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白，为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础。

【关键词】 蛋白质转导结构域； Foxp3； 突变； 穿细胞膜活性

　　［Abstract］ Objective: To express and purify a mutant mouse Foxp3 fusion protein containing a protein transduction domain from TAT and an enhanced green fluorescence protein (PTDeGFP△E250 mFoxp3)， furthermore to investigate its′s efficiency and ability transmembrane and laid the groundwork for future research about the function of mouse foxp3.Methods： The pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3 vector was constructed by inserting the PCR products of mouse mutant Foxp3 into pET28aPTDeGFP vector. The fusion protein was expressed by E. coli Rosetta (DE3) and purified by BioRad Profinity IMAC Nicharged Resin. The efficiency and ability of transmembrane of PTDeGFP△E250 mFoxp3 were detected by FCM and confirmed by confocal microscopy. Results： The vector of pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3 was constructed correctly and the fusion protein was expressed and purified efficiently. The results of FCM and confocal microscopy investigation indicated that PTDeGFP△E250 mFoxp3 fusion protein transduce into EL4 cell efficiently. Conclusion： The PTDeGFP△E250 mFoxp3 protein can transduce into cells efficiently and may be a useful tool to study the biological functions of Foxp3.

　　［Key words］ protein transduction domain；Foxp3；mutant；transmembrane ability

　　CD4+CD25hi调节性T细胞(regulatory T cells，Treg) 是一群具有免疫调节功能的成熟T细胞亚群，其通过抑制潜在的自身反应性CD4+CD25-T细胞，而在自身免疫耐受的形成、维持中发挥着重要的作用［1］。Foxp3(forkhead box P3 )属于Fox转录因子家族成员，2001年由Brunkow等首次报道［2］。2003年Rudensky， Ramsdel和Hori等研究小组均证明Foxp3特异性表达于CD4+CD25hiT细胞中，是Treg细胞的标志性蛋白之一，且Foxp3很大程度上决定了Treg细胞的发育和功能［3-5］。小鼠Foxp3蛋白结构包括N末端富含脯氨酸的结构域，中间C2h3锌指结构和亮氨酸拉链，而叉头状DNA结合域靠近蛋白C末端［6］。在人类中研究显示约70%发生严重的性联多内分泌腺和肠病变（immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy， and Xlinked inheritance，IPEX）综合征患者存在Foxp3突变，其中错义突变大多位于C末端叉头DNA结合区域，也有少数存在于亮氨酸拉链以及N端富含脯氨酸的区域。研究显示，发生在亮氨酸结构域的缺失突变（△E250）破坏了Foxp3的二聚化，并可影响Foxp3抑制功能的发挥［7］。

　　1988年Green和Franker分别发现人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type1，HIV1）编码的反式激活蛋白（transactivator transcription，TAT）具有独特的跨膜转运作用，可以引导多种多肽和蛋白质进入细胞内［8，9］。1997年，Vives等［10］研究证明，具有转导作用的是TAT中第47至57位的11个氨基酸残基，该片段具有富含碱性氨基酸、带较多正电荷的特点，其序列为：YCKRRKRQRRR，并把该片段称为蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）。PTD具有广谱的蛋白转导作用，转导速度快，效率高，可以把分子量为20～120 kDa的蛋白质导入细胞内［11-13］。基于PTD特有的跨膜转运功能，我们利用重叠延伸PCR方法扩增第250位谷氨酸缺失的Foxp3突变体（△E250），将其插入pET28aPTDeGFP载体中，构建了PTDeGFP△E250 mFoxp3表达质粒，在大肠埃希菌中表达PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白，利用eGFP示踪技术观察融合蛋白进入细胞后的分布，并对其转导活性和效率进行了分析，为下一步的研究奠定了实验基础。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　大肠埃希菌株DH5α，Rosetta（DE3）均由本室保存；EL4细胞为北京大学医学部T细胞研究室陈慰峰院士赠送，pET28aPTDeGFP和pET28aPTDFoxp3质粒由本室构建。核酸电泳分子量标准、低分子量标准蛋白质、rTaq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶HindⅢ，XhoⅠ和T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；氨苄西林、卡那霉素、IPTG购自南京建成生物公司；Profinity IMAC金属螯合填料购自BioRad公司，PD10脱盐预装柱为美国GE公司产品。

　　1.2 仪 器

　　Nikon激光共聚焦显微镜，XL2020型超声波破碎仪，FASCaliber以及CellQuest软件（美国BD公司）

　　1.3 方 法

　　1.3.1 引物设计及合成 Foxp3突变体引物序列：根据基因库中小鼠Foxp3基因序列和重叠延伸PCR的实验原理(图1)，设计两对引物，由上海生工生物公司合成：

　　引物A：CCCAAGCTTGCATGCCCAACCCTAGGCCAGCC (划线处为Hind Ⅲ酶切位点)；

　　引物B：CCGCTCGAGTCAAGGGCAGGGATTGGAGCAC(划线处为XhoⅠ酶切位点)。

　　引物C：GAAAAG (CTC) AAGCTGGGAGCTATGC（括号内为定点缺失突变的碱基）；

　　引物D：AGCTCCCAGCTT(GAG)CTTTTCCAGC（括号内为定点缺失突变的碱基）；

　　1.3.2 △E250 mFoxp3突变体的扩增 根据重叠延伸PCR的实验原理，分别进行三步PCR反应，以获得△E250 mFoxp3突变体产物。

　　如图1所示，第一步PCR以构建好的pET28aPTDFoxp3质粒为模板，用引物A、引物D进行扩增，获得产物AD；第二步PCR同样以pET28aPTDFoxp3质粒为模板，用引物B、C进行扩增，获得产物BC；最后以AD、BC产物为模板，用引物 A、引物B扩增产物AB（△E250 mFoxp3），上述PCR产物分别用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定。

　　图1 重叠延伸PCR扩增示意图

　　Fig 1 The map of splicing by overlap extension PCR

　　1.3.3 △E250 mFoxp3突变体产物的克隆 PCR大量扩增△E250 mFoxp3突变体产物，凝胶电泳分离纯化PCR产物，用胶回收试剂盒回收目的基因，将目的基因连接到pMD18T载体上，16℃过夜，连接产物转化至预先制备好的大肠埃希菌感受态DH5α，菌悬液均匀涂布在含氨苄西林（100 μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜。

　　1.3.4 阳性克隆的筛选与鉴定 随机挑取平板上的单个菌落，接种于含有氨苄西林的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，用小量碱裂解法小量提取质粒（命名为pMD18T△E250 mFoxp3），分别以各质粒为模板进行PCR鉴定和质粒Hind Ⅲ，Xho Ⅰ双酶切鉴定。

　　1.3.5 序列测定与BLAST分析 将PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性质粒送上海英骏公司进行测序，并在PubMed数据库中进行BLAST比对分析，确认突变位点和其余序列的正确性。

　　1.3.6 PTDeGFP△E250 mFoxp3原核表达质粒的构建 分别将经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切pMD△E250 mFoxp3的DNA片段和pET28PTDeGFP载体回收，以△E250 mFoxp3与载体摩尔比3∶1的比例，22℃连接过夜，构建pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3原核表达载体。将此质粒转化至预先制备好的大肠埃希菌感受态细胞Rosetta（DE3）菌，菌悬液涂布在含有Kan（50 mg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜。按照上面的方法进行鉴定。

　　1.3.7 PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的表达、鉴定与纯化 将筛选出的阳性克隆菌接种于含有Kan（50 mg/ml）的LB培养液中37℃振摇过夜，次日按体积比为1∶100接种于含有Kan的新鲜LB培养液中继续培养至D(600 nm)值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，30℃和37℃分别诱导2，4，6，8 h，取1 ml菌液以12 000 g，离心5 min，收集菌体，取少量加入100 μl PBS混悬，取20 μl混悬液与20 μl的2×SDS上样缓冲液混合后煮沸5 min，10 000 r/min离心10 min，进行SDSPAGE分析。

　　其余细菌以含8 mol/L尿素的结合缓冲液与菌体湿重之比为10 ml∶1 g加入结合缓冲液，冰浴中超声10×15 s裂解，离心收集上清，加入含有1 ml Profinity IMAC金属螯合填料的平衡柱，用含有10 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗涤，待流出液D(280 nm)趋近于0时，加入含有250 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液进行SDSPAGE分析。收集的目的蛋白去盐、过滤除菌后置-80℃保存。

　　1.3.8 流式细胞仪分析PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的穿膜能力和效率 EL4细胞培养在含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，5％CO2培养箱培养2天，收集对数生长期的细胞，Hank′s洗涤2次后，计数，按照5×105/孔接种于24孔板。每孔分别加入蛋白至浓度分别为625，1 250，1 875和2 500 nmol/L，每个浓度3个复孔，分别培养2，4，6，8 h，收集细胞，4℃ 1 500 r/min洗涤2次，最后加入500 μl PBS，采用流式细胞仪检测细胞内的eGFP荧光强度。

　　1.3.9 激光共聚焦显微镜观察穿膜蛋白在细胞内的定位 收集与640 nmol/L融合蛋白浓度共育2 h的细胞（5×105个/管），1 500 r/min离心10 min。预冷PBS洗2遍，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定30 min。离心去固定液，用PBS洗2遍。加入PI染色液（终浓度50 μg/ml），缓缓悬起细胞，4℃避光染色30 min，PBS洗涤。加50 μl PBS，重悬细胞并滴加至载玻片上，盖上洁净的盖玻片，指甲油封片。共聚焦显微镜下观察分析。

2 结 果

　　2.1 PCR扩增△E250 mFoxp3的结果

　　通过重叠延伸PCR，进行三步PCR反应，经1%琼脂糖电泳分析，显示扩增得到三个产物AD（747 bp）、BC（540 bp）及AB(即△E250 mFoxp3)（1 287 bp）（图2）。

　　2.2 克隆的筛选与鉴定

　　将构建好的重组质粒pMD18T△E250 mFoxp3转化大肠埃希菌，接种于氨苄西林平板上，挑取阳性菌落，进行PCR鉴定；同时对从阳性菌中提取的重组质粒进行Hind Ⅲ，Xho Ⅰ双酶切鉴定。电泳结果发现PCR产物和酶切片段位置正确（见图3）。

　　2.3 测序结果

　　测序结果BLAST分析显示：在748750位置有3个碱基（GAG）缺失（图4），与预先实验设计相符合。

　　2.4 PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的小量诱导表达与SDSPAGE电泳分析

　　pET28aPTDeGFP△E250 mFoxp3重组质粒转入大肠埃希菌Rosetta（DE3），在30℃或37℃，IPTG终浓度为1 mmol/L时，经不同时间诱导，收集菌体。总菌体经SDSPAGE分析，结果显示：经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在80 kD处有明显条带，30℃和37℃均见有表达，但是在30℃诱导表达后菌体呈现为绿色，而37℃诱导表达菌体未见绿色；30℃诱导4 h，融合蛋白表达量最高；而未诱导菌在相应位置没有明显的目的蛋白表达（图5）。同时对诱导表达的蛋白进行了溶解性分析，发现目的蛋白主要存在于沉淀中，即主要以包涵体的形式表达。

　　2.5 流式细胞仪分析融合蛋白穿膜能力

　　为检测PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白跨膜转导效率，我们将不同浓度的融合蛋白加入EL4细胞中分别作用不同的时间，利用流式细胞仪检测eGFP荧光强度。结果显示在同一时间段内，随着蛋白浓度的增高，蛋白的穿膜效率呈现抛物线样趋势，即在一定的浓度范围内，穿膜效率与蛋白浓度呈剂量依赖关系，但当达到某一最高合适的浓度后，随着蛋白浓度的加大，穿膜效率反而下降，因此蛋白穿膜的最佳效率应在融合蛋白最适浓度。同时结果发现，随着穿膜时间的延长，穿膜效率逐渐升高，到2 h达到最高峰，4 h后穿膜效率又逐渐下降，分析可能是随着时间的延长，蛋白发生了降解的原因。图6显示为不同浓度的融合蛋白穿膜2 h和4 h的流式细胞检测结果。

　　2.6 激光共聚焦显微镜下融合蛋白在细胞内的定位

　　由于在流式细胞术分析中不能确认融合蛋白是否能够确切进入细胞，特别是Foxp3蛋白作为转录因子必须进入细胞核才能发挥作用，因此我们采用共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布。结果发现与PTDeGFP△E250 mFoxp3共育的EL4细胞约80%有蛋白穿入，并且在细胞质和细胞核中均有融合蛋白分布(图7)。

3 讨 论

　　1995年，Sakaguchi等［14］首次报道了在机体中存在一类高表达IL2受体α链(IL2Rα CD25)的T细胞，且与自身免疫耐受有关，并将这类CD4+CD25hiT细胞命名为Treg。Treg在正常人和小鼠的外周血和脾组织的CD4+T细胞中占5%～10%，Treg功能特性包括两个方面：免疫无能性和免疫抑制性［15］。

　　图6 不同浓度的融合蛋白和EL4细胞共育2 h和4 h后的流式分析结果

　　Fig 6 Analysed transmembrane efficiency of fusionprotein by FCM

　　Foxp3的mRNA及其编码蛋白Scurfy相对特异地表达于CD4+CD25hiTreg，大量的研究表明Foxp3是控制Treg发育及其功能效应的关键基因［1］。有文献报道通过给CD4+CD25-T细胞转染Foxp3基因，可以将其转化为Treg样细胞。近年来的研究发现许多肿瘤患者外周血和肿瘤中的CD4+CD25hiTreg数量增多，抑制抗肿瘤免疫应答，我们试图通过采用PTD△Foxp3竞争阻断CD4+CD25+Treg内源性Foxp3蛋白的作用，从而解除或部分解除肿瘤引起的免疫抑制或耐受，达到清除肿瘤的目的［16］。因此我们根据基因库中小鼠Foxp3基因序列、Foxp3的基因结构特点和重叠延伸PCR的实验原理，在设计引物时于Foxp3亮氨酸拉链区域定点缺失第250位氨基酸谷氨酸的3个碱基，成功构建了含有缺失突变的PTDeGFP△mFoxp3原核表达载体，并成功进行表达和纯化了PTDeGFP△mFoxp3融合蛋白，同时检测融合蛋白能高效穿膜导入细胞内，获得了较好的实验结果，为进一步研究PTDFoxp3融合蛋白生物学功能与特性奠定了实验基础。

参考文献

［1］ Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses［J］. Annul Rev Immunol， 2004，22:531-562.

［2］ Brunkow ME， Jellbry EW， Hjerrild KA， et al. Disruption of one new fork head/wingedhelix protein， scurfin， results in the fatal lympho proliferative disorder of the scurfin mouse［J］. Nat Genet， 2001，27(1):68-73.

［3］ Fontenot JD， Gavin MA， Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells［J］. Nat Immunol， 2003， 4(4):330-336.

［4］ Khattri R， Cox T， Yasayko SA， et al. An essential role for Scrufin in CD4+CD25+ regulatory T cells［J］. Nat Immunol， 2003， 4(4):337-342.

［5］ Hori S， Nomura T， Sakaguchi S. Control of regulatory T cells development by the transcription factor Foxp3［J］. Science， 2003， 299(5609):1057-1061.

［6］ Ziegler SF. FOXP3: of mice and men［J］. Annu Rev Immunol， 2006，24:209-226.

［7］ Chae WJ， Henegariu O， Lee SK， et al. The mutant leucinezipper domain impairs both dimerization and suppressive function of Foxp3 in T cells［J］. PNAS， 2006，103 (25):9661-9636.

［8］ Green M， Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat transactivator protein［J］. Cell， 1988，55(6):1179-1188..

［9］ Frankel AD， Pabo CO. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus［J］. Cell， 1988，55(6):1189-1193..

［10］ Vives E， Brodin P， Lebleu B. A truncated HIV1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus［J］. J Biol Chem， 1997，272(25):16010-16017.

［11］ Egleton RD， Davis TP. Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain［J］. Peptides， 1997，18(9):1431-1439.

［12］ Spitere K， Toulouse A， O′Sullivan DB， et al. TATPAX6 protein transduction in neural progenitor cells: A novel approach for generation of dopaminergic neurones in vitro［J］. Brian Res， 2008，1208:25-34.

［13］ 黄莉莉， 邵启祥， 张 慧， 等. PTDFoxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究［J］. 江苏大学学报:医学版， 2007，17(3):186-192.

［14］ Sakaguchi S， Sakaguchi N， Asano M， et al. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL2 receptor alphachains (CD25). Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases［J］. J Immunol， 1995，155(3):1151-1164.

［15］ Fehervari Z， Sakaguchil S. Development and function of CD25+CD4+ regulatory T cells［J］. Curr Opin Immunol，2004， 16(2):203-208.

［16］ Xu L， Xu W， Jiang Z， et al. Depletion of CD4(+)CD25(high) regulatory T cells from tumor infiltrating lymphocytes predominantly induces Th1 type immune response in vivo which inhibits tumor growth in adoptive immunotherapy［J］. Cancer Biol Ther， 2009，8(1):41-47.