VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响

　　　　 作者：杨家红 谢嵘 王莹 范昕

【摘要】 目的： 从胰腺腺泡细胞凋亡的角度探讨血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体在胰腺缺血再灌注损伤中保护作用。方法： 采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血再灌注损伤模型，并应用细胞凋亡原位标记法(TUNEL)、免疫组化技术等检测VEGF单克隆抗体干预后对胰腺细胞凋亡及Bax，Bcl2蛋白表达的影响。结果： 干预组15，30，60 min胰腺细胞凋亡指数显著低于缺血再灌注组(P&<0.01)。正常胰腺组织未见凋亡调控基因Bcl2的表达， VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Bcl2染色阳性率明显高于缺血再灌注组(P&<0.01)；正常胰腺组织见较弱的凋亡调控基因Bax的表达，而VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Bax染色阳性率明显低于缺血再灌注组(P&<0.01)。结论： VEGF单克隆抗体能够通过抑制胰腺腺泡细胞的过度凋亡减轻胰腺炎的严重程度，该作用可能是通过促进抗凋亡Bcl2基因表达，抑制促进凋亡基因Bax表达来实现的。

【关键词】 胰腺； 缺血再灌注； 细胞凋亡； VEGF单克隆抗体； Bax； Bcl2

　　［Abstract］ Objective: To investigate the effect of VEGF McAb protecting on pancreas injury during experimental ischemic/reperfusion in rats.Methods： Ischemic/reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celica artery of 70 rats.Apoptosis of pancreatic acinar cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method， and the expression of apoptosis regulated gene Bax and Bcl2 was detected by immunohistochemical technique. Results： The index of apoptosis increased significantly in pancreatic tissues after pancreatic ischemia/reperfusion injury but offset by administration of VEGF McAb.Immunohistochemical analysis showed that just weak Bax staining cells were detected， with no Bcl2 positive staining cells in normal pancreatic tissues.The positive rate of Bcl2 protein in VEGF McAb group was significantly higher than ischemic/reperfusion group while the positive rate of Bax was significantly lower(all P&<0.01). Conclusion： VEGF McAb treatment alleviated pancreatic ischemia/reperfusion injury by restraining excessive apoptosis.This effect might be related with upregulating the expression of Bcl2 and downregulating the expression of Bax.

　　［Key words］ pancrease; ischemic/reperfusion; apoptosis; VEGF McAb; Bax; Bcl2

　　缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是一种常见的临床病理生理过程，在急性胰腺炎(AP)的发病机理中起着重要作用。近年的研究发现，I/R损伤与细胞凋亡有着密切的联系［1］，现已证实，AP大鼠的发病过程中胰腺存在细胞凋亡的改变，且与其病变的严重程度有关［2］。本实验旨在探讨血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体在I/R损伤后对胰腺细胞凋亡的影响及其可能的机制，以探讨AP治疗的新途径。

1 材料与方法

　　1.1 动物及主要试剂

　　清洁级SD大鼠共70只，雌雄不限（江苏大学医学院实验动物中心提供），VEGF单克隆抗体（Santa Cruz 公司），鼠抗Bcl2单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）、兔抗Bax单克隆抗体（Santa Cruz公司），链霉素亲生物素过氧化物酶标(SP)免疫组化试剂盒(Biotech公司产品)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 动物分组 成年Wistar大鼠70只，随机分为对照组(10只)、缺血再灌注损伤组(30只)和VEGF单抗干预组(30只)，其中缺血再灌注损伤组和VEGF单抗干预组再分为15，30，60 min 3个时间点组，每组10只。

　　1.2.2 动物模型制作 术前12 h禁食不禁水， 0.5%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切开，找到腹腔干和肠系膜上动脉。对照组不用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉，直接取胰腺组织标本，心脏穿刺取血2 ml；缺血再灌注损伤组和VEGF单克隆抗体干预组分别以血管夹阻断腹腔干和肠系膜上动脉15，30，60 min(各10只)后再灌注6 h，取胰腺组织标本。

　　1.2.3 干预及处理 VEGF单克隆抗体干预组于术前5 min 尾静脉注射VEGF单克隆抗体100 μg/300 g，缺血再灌注损伤组仅注射等量生理盐水。

　　1.3 胰腺组织的检测

　　1.3.1 胰腺细胞凋亡的检测 按Boenger Manheim公司试剂盒说明操作，光镜下观察计算凋亡指数。凋亡指数(apoptosis index，AI)计算方法:数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%

　　1.3.2 免疫组化SP法检测胰腺组织细胞凋亡基因 胰腺组织常规石蜡切片， 二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，胰蛋白酶液消化，室温20 min。以下步骤按SP试剂盒说明操作， 光镜下计算胰腺细胞Bax，Bcl2染色阳性率。结果判断: 细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性，Bax，Bcl2免疫阳性反应定位于细胞核。胰腺细胞染色阳性率计算方法: 数4个高倍视野， 分别计算阳性细胞数和总细胞数， 阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

　　1.4 统计学处理

　　用SPSS11.5统计软件行方差齐性检验、方差分析、t检验和t′检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 胰腺细胞的凋亡情况

　　对照组中有少量腺泡细胞的凋亡，且组内各时间点凋亡指数相当。缺血再灌注组及VEGF单抗干预组的凋亡指数随着缺血时间的延长，逐渐加重，均明显高于对照组(P&<0.01)。VEGF单抗干预组凋亡指数均明显低于同时间点缺血再灌注组(P&<0.01)。见表1。

　　2.2 胰腺腺泡细胞Bax 表达的变化

　　正常胰腺组织见较弱的凋亡调控基因Bax的表达，而VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Bax 染色阳性率明显低于缺血再灌注组（P&<0.01）。见表2。表1 各组凋亡指数的比较表2 各组凋亡调控基因Bax，Bcl2 染色阳性率比较a:与缺血再灌注组同时间点比较， P&<0.01

　　正常胰腺组织未见有Bcl2 表达，VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Bcl2染色阳性率明显高于缺血再灌注组(P&<0.01)。

3 讨 论

　　目前认为， I/R 是胰腺炎、尤其是胰腺移植后胰腺炎的重要原因［3］，而VEGF可能是其加重因素。其原因可能为VEGF参与了在I/R中白细胞-内皮细胞的相互作用；同时有研究表明VEGF本身能增加血管通透性增加，降低功能性血管密度，加重缺血损伤［4］。再灌注期，浸润的炎症细胞释放的炎症介质与氧自由基、细胞因子等相互作用、互为因果，形成瀑布样效应，造成微循环紊乱，从而使胰腺损伤进一步加剧［5］。应用VEGF单克隆抗体后，能够减轻起始阶段的炎症因子与白细胞-内皮细胞的相互作用，减轻瀑布样反应。

　　目前认为，细胞凋亡由两条通路调节：细胞表面死亡受体通路和线粒体通路，这两条通路都参与了胰腺缺血再灌注损伤中的细胞凋亡，比较受重视的是凋亡发生的线粒体途径。在线粒体途径中，Bcl2家族蛋白在其中起重要作用。本研究选择的两个基因Bax 和Bcl2是凋亡调控基因Bcl2家族成员之一，Bax可形成同源二聚体BaxBax，促进细胞凋亡的发生;而当Bcl2存在时，Bcl2可以与Bax形成比BaxBax二聚体更稳定的BaxBcl2异源二聚体，从而中和BaxBax二聚体的促凋亡作用。因此Bcl2/Bax的比例可决定细胞的命运，其比例增高，细胞不易发生凋亡，比例降低则导致细胞凋亡。当Bax过度表达时可抑制Bcl2功能而促进细胞凋亡［6］，Bcl2，Bax二者作用相互拮抗［7］。在我们早期研究中发现白细胞介素1受体拮抗剂可以通过调节Bcl2，Bax表达胰减轻腺炎的严重程度［8］。本实验显示在正常胰腺组织未见凋亡调控基因Bcl2表达而Bax弱表达。VEGF单抗干预组及缺血再灌注组15，30，60 min的胰腺细胞Bax染色阳性率高于对照组，VEGF单抗干预组Bax染色阳性率明显低于缺血再灌注组相应时间点；VEGF单抗干预组胰腺细胞Bcl2 染色阳性率明显高于缺血再灌注组15，30，60 min染色阳性率(P均&<0.01)。

　　在胰腺缺血再灌注损伤早期便可出现细胞凋亡，这可能是胰腺缺血再灌注损伤早期的主要表现。过多的细胞凋亡超过组织自身的清除能力，凋亡的细胞会向坏死转化，反而会加重再灌注后的炎症反应，故胰腺出现较多的凋亡细胞不利于胰腺功能的恢复。通过实验我们推测VEGF单克隆抗体可能通过上调抑制凋亡基因Bcl2的表达，抑制促凋亡基因Bax表达来抑制缺血再灌注过程的细胞过度凋亡，保护胰腺细胞。

参考文献

［1］ Fujimoto K， Hosotani R， Wada M， et al.Ischemiareperfusion injury on the pancreas in rats: identification of acinar cell apoptosis［J］.J Surg Res， 1997，71(2):127-136.

［2］ 常 华， 严际慎， 罗建飞， 等.大鼠急性胰腺炎胰腺细胞凋亡改变的实验研究［J］.肝胆胰外科杂志， 2001，13(3):147-148.

［3］ Fan H， Sun B， Gu Q， et al.Oxygen radicals trigger activation of NFkappaB and AP1 and upregulation of ICAM 1 in reperfused canine heart［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2002， 282(5):H1778-H1786.

［4］ von Dobschuetz E，Meyer S，Thorn D， et al.Targeting vascular endothelial growth factor pathway offers new possibilities to counteract microvascular disturbances during ischemia/reperfusion of the pancrea［J］.Transplantation，2006，82(4)：543-549.

［5］ Toda K， Kayano K， Karimova A， et al.Antisense intercellular adhesion molecule1(ICAM1) oligodeoxyribonucleotide delivered during organ preservation inhibits posttransplant ICAM1 expression and reduces primary lung isograft failure［J］.Circ Res，2000， 86(2): 166-174.

［6］ Oltvai ZN，Milliman CL， Korsemeyer SJ.Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved hemology， bax， that accelerates programmed cell death［J］.Cell， 1993， 74（4）: 609-613.

［7］ Reed JC，Zha H， AmieSempe C，et al.Structurefunction analysis of Bcl2 family proteins.Regulators of programmed cell death［J］.Adv Exp Med Biol，1996， 406: 99-112.

［8］ 毛正发，张建新，瞿建国，等.白细胞介素1受体拮抗剂诱导急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡机制的研究［J］.江苏大学学报:医学版，2007，17（5）：396-399.