铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究

　　 作者：陈建国，苏兆亮，柳迎昭，王胜军，彭素芳，李雅贞，邵启祥， 许化溪

【摘要】 　　目的： 构建铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）多表位MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究。方法： 将PA 外膜蛋白F（OprF）的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联，采用重叠PCR方法合成DNA，并在此序列前插入组织型纤溶酶原（tPA）的信号肽基因，将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIREStPAOprF:MyD88，并将该质粒免疫Balb/c小鼠，采用ELISA法测定特异性抗体水平。气管内接种PA，进行肺组织匀浆PA细菌计数。结果： 成功构建真核表达质粒pIREStPAOprF:MyD88，用该质粒免疫小鼠，能刺激机体产生高度特异性抗体，气管接种PA后，免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组。结论： 成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗，接种小鼠后可诱导特异性免疫应答，产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用。

【关键词】 铜绿假单胞菌； 外膜蛋白F； MyD88； 表位疫苗； 免疫原性

　　［Abstract］Objective: To construct the Pseudomonas aeruginosa multiepitopeMyD88 gene vaccine and to study its immunogenicity in Balb/c mices. Methods： The epigene was designed and synthesized， containing three B cell epitopes of OprF and one foreign ′promiscuous′T cell epitope by overlap extension PCR， and tPA signal encoding sequence was amplified by PCR method and then was inserted to the 5′terminus of the epigene to construct tPAOprF DNA fragment. The DNA fragment and MyD88 gene were cloned into expression vector pIRES to construct recombinant plasmid pIREStPAOprF:MyD88. Balb/c mice were inoculated with pIREStPAOprF:MyD88 plasmid， and the serum antibody titer was measured by ELISA. The number of viable bacteria in lung homogenate was examined after intratracheal challenge with Pseudomonas aeruginosa. Results： The recombinant plasmid pIREStPAOprF:MyD88 was successfully constructed. Mice were immunized with this epigene vaccine， and the result showed that the higher level of antigen specific antibody was detected， and resulted in a fewer number of bacteria in the lung as compared with control plasmid treatment. Conclusion： The construction of the Pseudomonas aeruginosa multiepitopeMyD88 gene vaccine was proved to be successful and it could elicit dramatic immune response， and then can protect mice against Pseudomonas aeruginosa infection when it was applied as the epitope vaccine in experimental animal.

　　［Key words］Pseudomonas aeruginosa; OprF; MyD88; epitope vaccine; immunogenicity

　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种条件致病菌，其对多种抗菌药物表现为天然或获得性多重耐药，所致感染可供选择的有效抗菌药物甚少，困扰着临床PA感染的治疗，因此，预防PA的感染显得十分重要。研究表明：PA感染或其相关外膜蛋白F（OprF）的主动免疫，能诱发机体产生特异性体液免疫应答，有效地发挥局部保护作用［1，2］。然而，OprF的完整蛋白对机体具有潜在的危害性。而现有研究表明OprF蛋白含有大量的B细胞表位，其中抗原性强的表位集中在氨基酸残基190～342位置。因此，应用OprF优势抗原表位设计的疫苗，既能够诱导机体产生抗PA中和抗体，又能克服非抗原决定簇成分潜在的毒副作用。考虑到表位疫苗的免疫原性较弱，不足以引发良好的免疫应答，故利用新型免疫佐剂MyD88来调节机体的免疫应答［3］。本研究在此基础上构建了表位疫苗，并对其免疫原性进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　6～8周龄雄性Balb/c小鼠，体质量20～25 g，购自扬州大学比较医学中心。

　　1.2 载体、菌株及质粒

　　真核表达载体pIRES购自美国Invitrogen公司，E.coli DH5a为本室保存，pFLAGCMV4hMyD88质粒由日本Fumihiko Takeshita 博士惠赠。

　　1.3 试剂和仪器

　　ExTaq DNA聚合酶、dNTP，T4 DNA连接酶、内切酶BamHⅠ、DNA 标准参照物购自Takara公司；内切酶NheⅠ，MluⅠ，XbaⅠ和NotⅠ均购自Fermentas公司；质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；抗OprF多克隆抗体由本室制备；抗人MyD88多克隆抗体购自eBioscience公司。主要仪器：Eppendorf PCR扩增仪；BioRad电泳仪；Gene凝胶成像及分析系统；Heraeus高速冷冻离心机；Thermo低温冰箱。

　　1.4 PA OprF B细胞表位疫苗的构建与鉴定

　　以文献［4-6］报道的PA OprF B细胞表位为基础，从中优选3个B 细胞表位（Peptide 9: TDAYNQKLSERRAN；Peptide 10: NATAEGRAINRRVE；Peptide 18: NEYGVEGGRVNAVG），并加入白喉毒素通用T细胞表位（QYIKANSKFIGITE）。将这4个表位依次串联起来，表位之间以赖氨酸间隔，采用大肠埃希菌的优势密码子，将上述构建的疫苗氨基酸序列转换为DNA序列，采用重叠PCR方法进行合成，并在此序列前插入组织型纤溶酶原（tPA）的信号肽基因，将此获得的片段与MyD88基因分别克隆到pIRES载体的2个多克隆位点构建双表达重组质粒pIREStPAOprF:MyD88，进行酶切鉴定，并送测序。

　　1.5 重组质粒免疫动物

　　采用Axygen公司去内毒素质粒提取试剂盒大量提取质粒。Balb/c小鼠随机分为pIRES（空质粒）阴性对照组、pIREStPAOprF组及pIREStPAOprF:MyD88组，每组5只。双侧股四头肌注射质粒，每组每只50 μg/次，同时注射5 mg/ml的盐酸丁哌卡因20 μl/只。共免疫3次，每次间隔2周，末次免疫后2周采血用于抗体检测。

　　1.6 ELISA检测血清特异性抗体水平

　　采用间接法，以本实验室前期制备的OprF融合蛋白包被酶标板，加待检血清孵育30 min，加酶标二抗孵育30 min，加底物显色，测定492 nm的光密度（D）值。

　　1.7 肺脏清除PA的定量分析

　　为了评估肺脏清除PA的能力，将末次免疫后2周的Balb/c小鼠氯氨酮麻醉后，切开颈部皮肤，显露气管，气管内接种20 μl（含5.0×106 cfu）PA的PBS，接种24 h时处死小鼠，无菌条件下取肺组织，加入PBS匀浆，10倍系列稀释肺匀浆，置LB板，37 ℃孵育24 h，计数生长的菌落数。

　　1.8 统计学方法

　　数据用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PA OprF B细胞表位疫苗的构建与鉴定

　　将合成的tPAOprF和MyD88基因先后克隆到同一pIRES载体上，分别用NheⅠ和MluⅠ，NotⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定。结果表明，与插入片段长度相符（图1）。DNA序列测定与设计的已知序列均完全一致，无突变发生，表明重组质粒构建成功。

　　2.2 免疫小鼠血清特异性抗体水平测定

　　末次免疫后2周，检测表明：表位疫苗能诱导小鼠产生特异性抗体，与tPAOprF基因免疫相比，tPAOprF:MyD88融合基因免疫小鼠血清中诱导小鼠产生的特异性抗体水平显著高于阴性对照组，并较tPAOprF基因免疫组增高，差异有统计学意义（P&<0.01）（图2）。

　　2.3 肺脏清除PA能力的初步实验

　　感染PA 24 h后，采用倾注平板法计数肺组织匀浆中菌落数，pIREStPAOprF:MyD88基因免疫组小鼠肺组织匀浆中生长PA明显少于空质粒对照组和tPAOprF基因组（P&<0.01）（图3），表明tPAOprF：MyD88融合基因免疫组清除PA的能力显著增强。

　　3 讨论

　　多表位疫苗是指同时携带多个与目标抗原相关的以及辅助性的表位疫苗，它能克服MHC分子的遗传限制，可被多种遗传背景的MHC分子识别并结合，从而有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的一些不利因素。近年来，多表位疫苗已在多种病原体的疫苗设计中得到应用，成为疫苗发展的方向。

　　本研究在首先尝试采用OprF的3个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位，将此4个表位依次串联起来，表位之间以赖氨酸（KK）间隔，这样有利于表位肽的体内切割，便于各个表位单独发挥效应，并且避免在表位的连接处产生新的结合位点［7，8］，然后，采用大肠埃希菌的优势密码子，将上述构建的疫苗的氨基酸序列转化为DNA序列。并在此序列前插入tPA信号肽序列，以有效促进异种蛋白的分泌，抗原递呈细胞可以将此分泌蛋白作为外源性抗原摄取， 然后通过溶酶体途径对其处理加工，与MHC II分子结合后递呈给CD4+T 淋巴细胞，主要诱导促进机体的体液免疫应答，而体液免疫应答对于PA预防和控制至关重要。

　　在PA的抗感染免疫中，PA DNA疫苗诱导Th3型免疫应答，激发IgG产生。为了增强表位疫苗的免疫原性，高效刺激机体的体液免疫应答能力，提高疫苗的免疫效果，本研究选择了MyD88基因重组于PA外膜蛋白基因疫苗，以期发挥免疫佐剂作用。MyD88是Toll样受体（Tolllike receptors，TLR）介导的先天性免疫反应信号通路中一个重要的接头蛋白，在固有和适应性免疫应答中均发挥重要作用。MyD88能启动核转录因子NFκB依赖的信号级联反应，促进抗原提呈细胞的活化和成熟（包括抗原的加工和提呈、上调MHC和共刺激分子、分泌促炎症趋化因子和细胞因子），激发机体产生针对抗原肽的特异性免疫应答［9］。另外，MyD88也具有促进B细胞活化，增强体液免疫应答的能力。Takeshita等［10］将编码肿瘤或病毒DNA抗原的基因与MyD88基因构建的共表达质粒疫苗免疫小鼠，结果发现机体可产生高水平的抗体，具有较强的免疫保护作用。显示出MyD88有希望作为一类新型的免疫佐剂在抗肿瘤、抗感染方面具有较好的应用前景。

　　本实验采用pIRES构建真核双表达载体，在启动子下游MCSA的酶切位点NheⅠ和MluⅠ之间，插入含有tPA信号肽的PA多表位肽基因片段，在MCSB的酶切位点NotⅠ 和XbaⅠ之间，插入人源性的MyD88基因片段，获得真核双表达载体pIREStPAOprF:MyD88。这样，插入的目的基因在体内表达后，抗原部分分泌到细胞外诱导体液免疫应答，MyD88发挥强化抗原提呈和信号传导作用。

参考文献

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