hGITRaa1165IgG1Fc真核表达质粒的构建及其表达

　　　　 作者：崔大伟 王胜军 陈君 仝佳 陈建国，王海生 杨先知 史烨 许化溪 邵启祥

【摘要】 目的： 构建含有人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）胞外段基因的真核表达质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)，检测hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白在真核细胞COS7中的表达。方法： 以pGEMTGITR质粒为模板，通过PCR扩增获得人GITR胞外段的基因hGITRaa1165，将该目的基因连接至IgG1FcpcDNA3.1(+)质粒，构建hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)真核表达质粒。将该重组质粒采用脂质体法转染COS7细胞，通过SDSPAGE和蛋白质印迹法检测hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白在真核细胞COS7中的表达。结果： 成功构建真核表达质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)，并在其转染的COS7细胞培养上清中检测到hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的表达。结论： 成功表达hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白，为进一步研究GITR的生物学功能奠定了基础。

【关键词】 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体； COS7细胞； 真核表达

　　［Abstract］ Objective: To constructed recombinant eukaryotic plasmid hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)， then to express the fusion protein hGITRaa1165IgG1Fc in COS7 cells.Methods： The hGITRaa1165 gene was obtained by PCR amplification from the pGEMTGITR vector and inserted into the vector hIgG1FcpcDNA3.1(+). The COS7 cells were transfected in the mediation of liposome mixed with hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)vector， the fusion protein hGITRaa1165IgG1Fc in the culture supernatant was analyzed by SDSPAGE and Western blots. Results： The hGITRaa1165IgG1Fc fusion protein was analyzed in the culture supernatant in the COS7 cells which were transfected with the hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+) vector. Conclusion： The fusion protein hGITRaa1165IgG1Fc was successfully expressed in COS7 cells， providing research foundation for biology of hGITR.

　　［Key words］ glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor(GITR)； COS7 cells； eukaryotic expression

　　人类糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（human glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor，hGITR），也被称为TNFRSF18。天然CD4+CD25+Treg细胞组成性高表达GITR，而静止T细胞低水平表达，其膜表达量会随着T细胞的激活而增加［1，2］。GITR与其配体(GITRL)的相互作用与自身免疫疾病、慢性感染、抗肿瘤免疫等相关。GITR与GITRL结合后，可呈现增强效应T细胞的活化和取消Treg细胞的抑制功能的特点［3］。因此，关于GITR与GITRL相互作用的机制及其在肿瘤免疫，机体炎症及某些自身免疫疾病中的作用有待于更深入的研究。本研究成功克隆人GITR胞外区基因，构建GITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体，并在COS7细胞中获得功能性表达，为进一步研究GITR的生物学功能奠定了良好的基础。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　Ex Taq DNA聚合酶、高GC 缓冲液 I（Takara公司），梭华SofastTM脂质体（厦门太阳马生物工程有限公司），ECL发光试剂盒（GE.Healthcare公司），HRP羊抗小鼠IgG（美国KPL公司），CCK8试剂盒（DOJINDO公司）。质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)由华中科技大学同济医学院免疫教研室吴雄文教授惠赠。pGEMThGITR，pIRES2eGFP，小鼠抗人GITR多克隆抗体，COS7，HUEVC，THP1细胞株由本室保存。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 PCR引物的设计 根据基因库中人GITR基因（序列号为AY358877）胞外段序列（hGITRaa1165）以及质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)多克隆位点［hIgG1Fc段已经插入pcDNA3.1(+)载体的EcoR I与Xho I位点之间］，通过Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

　　正链引物F1（5′端加Hind Ⅲ酶切位点），序列为：5′CCTAAGCTTATGGCACAGCACGGGGCGAT3′；反链引物R1（5′端加BamH I酶切位点），序列为：5′GTCCTAGGCCACCCAAGCGGCTCTGC3′。同样，根据质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)多克隆位点及eGFP基因序列，设计eGFP对照引物：正链引物F2（5′端加Hind Ⅲ酶切位点），序列为:5′ATTAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAG3′；反链引物R2（5′端加BamH I酶切位点），序列为：5′ATTGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCAT3′(斜体字为保护碱基，加下划线为酶切位点)。

　　1.2.2 PCR扩增GITR胞外区基因及eGFP基因 以pGEMThGITR质粒为模板，通过PCR扩增获得hGITRaa1165基因。扩增条件为：94℃ 5 min预变性，94 ℃ 变性30 s，63 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸30 s，共28个循环，72 ℃延伸10 min。以pIRES2eGFP为模板，通过PCR扩增获得eGFP基因，扩增条件为：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 变性30 s，62 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸1 min，共28个循环，72 ℃延伸10 min。

　　1.3 构建hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)和eGFPIgG1FcpcDNA3.1(+)质粒

　　将载体hIgG1FcpcDNA3.1(+)和目的基因eGFP，hGITRaa1165分别进行Hind Ⅲ， BamH I双酶切，通过T4DNA连接酶构建对照质粒eGFPIgG1FcpcDNA3.1(+)和表达质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)。将目的质粒进行基因测序，将测序正确的阳性菌液扩增培养，抽提质粒备用。测抽提的质粒浓度，D（260/280）＝1.82，C＝573 μg/ml。

　　1.4 脂质体法转染COS7细胞

　　将COS7细胞按3.0×105/孔接种于6孔板中（含10%新生牛血清的DMEM），将 2 μg阳性质粒及6 μl梭华SofastTM分别稀释于100 μl不含血清和抗生素的DMEM中，轻轻混匀。将 100 μl梭华SofastTM稀释液滴加到上述100 μl DNA 稀释液中，室温孵育 15～20 min。将200 μl 梭华SofastTM/DNA复合物加到孔中并轻轻混匀，放置 37℃，5% CO2培养箱孵育24 h［5］，进行荧光拍照。

　　1.5 SDSPAGE和蛋白质印迹法鉴定hGITRaa1165IgG1Fc 融合蛋白

　　SDSPAGE和蛋白质印迹法操作参见分子克隆， 一抗为小鼠抗人GITR的多克隆抗体， 二抗为HRP羊抗小鼠IgG抗体， ECL发光显示结果。

　　1.6 hGITRaa1165IgG1Fc 融合蛋白分别与THP1，HUEVC细胞共培养

　　THP1，HUEVC细胞按1.0×104/孔分别接种于48孔板中，设立空白孔（培养液），阴性孔（COS7细胞培养上清），eGFP孔［eGFPIgG1FcpcDNA3.1(+)转染COS7细胞后培养上清］，目的蛋白孔（hGITRaa1165IgG1Fc 融合蛋白上清）。除空白孔外，每孔各加入50 μl转染细胞的培养上清，用含10%新生牛血清的DMEM培养液调整体积为200 μl/孔，培养24，48，72 h，分别进行细胞计数。同以上操作步骤将THP1细胞按1.0×104/孔接种于96孔板，培养24 h后，通过CCK8法于450 nm波长处测定其D值。

　　1.7 统计学分析

　　所有数据以均值±标准差（±s）表示，采用SPSS10.0进行统计分析。对各组数据进行成组χ2检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 hGITRaa1165片段的扩增

　　进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，扩增出495 bp的单一扩增带，和预期扩增片段大小一致，无非特异扩增(图1a)。

　　2.2 hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)真核载体的构建及鉴定

　　将目的基因双酶切后，插入hIgG1FcpcDNA3.1(+)载体的Hind Ⅲ和BamH Ⅰ位点之间，经Hind Ⅲ+BamH Ⅰ和Hind Ⅲ+XhoⅠ双酶切鉴定，获得了hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)表达载体(图1b)。重组质粒经DNA自动测序仪（上海英骏测序公司）测序，基因序列正确。

　　2.3 质粒hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)转染后荧光图

　　hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)质粒转染COS7细胞，同时转染对照质粒eGFPIgG1FcpcDNA3.1(+)，24 h后拍得荧光/白光图片（图2）。

　　在hGITRaa1165IgG1FcpcDNA3.1(+)表达载体转染的COS7细胞培养上清中可检测到hGITRaa1165IgG1Fc蛋白的表达，经SDSPAGE和蛋白质印迹鉴定，该融合蛋白相对分子质量约53 kD，与预期大小一致（图3）。

　　2.4 hGITRaa1165IgG1Fc 融合蛋白促进THP1细胞的增殖

　　在THP1，HUEVC培养孔中，分别加入hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白，在不同时间段进行细胞计数并测定D值，结果显示该融合蛋白相对于eGFP组对THP1细胞生长具有一定的促进作用（P&<0.05）（图4），而对HUEVC细胞生长未见明显影响(P&>0.05)（图5）。

3 讨 论

　　人GITR（hGITR）基因位于1号染色体，其开放阅读框架包含726 bp，编码的蛋白由241个氨基酸组成，胞质区包含49个氨基酸，跨膜区为27个氨基酸，胞外区由139个氨基酸组成。 GITR在细胞表面呈同型二聚体结构，与TNFRSF中的41BB，CD27，OX40及CD40具有一定的同源性。研究表明在效应性T细胞、Treg细胞及APC上都有GITR/GITRL的相互作用，在免疫系统不同细胞中GITR及GITRL介导信号的相互作用决定了最终的应答效应。GITR的激活可打破Treg细胞介导的免疫耐受，一方面可诱发或加重自身免疫性疾病［6-8］。另一方面却有助于机体清除感染的病原微生物以及增强对肿瘤的免疫应答等［9-11］。最近研究表明在小鼠脊柱损伤修复实验中，小鼠GITRFc融合蛋白可抑制小鼠T细胞的活化，减少炎症因子的产生，从而起到抗炎的作用［12］。

　　深入研究GITR对探讨肿瘤的病理过程及自身免疫病的发病机制具有潜在的重要意义。本实验中，我们构建hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的载体，即含人IgG1Fc基因的质粒hIgG1FcpcDNA3.1(+)，是通过将含人IgG1Fc段插入pcDNA3.1(+)的EcoR I与Xho I位点之间构建的。GITR胞外段长495 bp，含有3个特征性的半胱氨酸假性重复区(CRP)，该CRP区又称为TNFRSF成员的结构基序，是其结合配体后发挥生物学功能的结构基础。人IgG1Fc基因片段编码IgG1的铰链区及Ch3与CH3功能区，将GITR胞外段与人IgG1Fc段链接，不仅提高了表达的GITR胞外段蛋白的稳定性，还为该融合蛋白的纯化与检测提供了一个方便的标记。本试验中，我们构建了hGITRaa1165IgG1Fc pcDNA3.1(+)真核表达质粒，SDSPAGE和蛋白质印迹法检测到融合蛋白hGITRaa1165IgG1Fc在COS7细胞中的表达，蛋白质相对分子质量约为53 kD。研究已知，THP1，HUEVC细胞表面表达GITRL，为了解表达的hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白的活性，我们将该融合蛋白加入THP1，HUEVC细胞培养孔中，发现hGITRaa1165IgG1Fc 融合蛋白对THP1细胞的增殖具有一定的促进作用，而对HUEVC细胞未有明显作用，以上研究表明hGITRaa1165IgG1Fc与小鼠GITRFc融合蛋白在人和鼠可能存在不同的生物学功能，而且对于不同的细胞，hGITRaa1165IgG1Fc也表现不同的作用。至于hGITRaa1165IgG1Fc蛋白对THP1细胞的作用机制还需要进一步实验研究。

　　综上所述，我们应用重组DNA技术与真核表达系统，获得了hGITRaa1165IgG1Fc融合蛋白，为后续的工作打下了一定的基础:一方面，可溶性的hGITRaa1165IgG1Fc结合配体后，在体内即可阻断GITRGITRL之间的相互作用，为将其用于自身免疫性疾病及肿瘤的治疗提供实验依据;另一方面，将可溶性hGITRaa1165IgG1Fc蛋白纯化后，为进一步探讨GITR在免疫自稳调节、自身免疫性疾病和肿瘤免疫中的地位，以及探索GITR的其他生物学功能，提供了实验基础。

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