不同周龄NZBW F1鼠肾脏损害及脾淋巴细胞活化和凋亡的比较

【摘要】 目的： 比较24周龄和32周龄NZBW F1鼠肾脏损害及脾淋巴细胞活化、凋亡的不同。方法： 随机将NZBW F1鼠分为两组：24周龄组和32周龄组。用考马斯亮蓝法每周检测小鼠24 h尿蛋白量。分别在24周龄和32周龄时取小鼠肾脏组织切片PAS染色观察病理。取脾脏分离淋巴细胞，分别在刀豆球蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）刺激下，流式细胞仪检测T，B淋巴细胞的CD69，CD28和CD86的表达和T淋巴细胞的凋亡情况。结果： 24周龄组NZBW F1鼠T细胞CD69，CD28表达及B细胞CD69表达均高于32周龄鼠，CD86无明显变化，T细胞凋亡率下降。32周龄组时24 h尿蛋白量明显增加，肾脏损害较24周龄组严重。结论： 24周龄组与32周龄组NZBW F1鼠相比，淋巴细胞活化增加，凋亡减少，而32周龄组肾脏损害严重，这与其自发病程有关。

【关键词】 红斑狼疮； 系统性； 肾脏； 淋巴细胞； 凋亡

　　［Abstract］ Objective: To compare the differences of renal pathology and splenic lymphocytes activation and apoptosis between 24weekold and 32 weekold NZBW F1 mice in vitro.Methods： Applied 15 NZBW F1 mice as observed objectives，they were pided into two groups randomly:24weekold group and 32weekold group.Coomassie brilliant blue method was used to detect 24hour proteinuria every week.At the age of 24 weeks or 32 weeks，kidneys and spleens were abtained from mice，kidneys were dyed by PAS and the variation of renal pathology were observed.Splenic lymphocytes were isolated and cultured.Under ConA or LPS stimulating，the immunophenotypes(CD69，CD28，CD86) of lymphocytes and the Tlymphocytes′ apoptosis were analysed by flow cytometry. Results： It was found that the expression of CD69，CD28 of Tlymphocytes and CD69 of Blymphocytes in 24weekold group were signifcantly higher than that in 32weekold group，and no difference of the expression of CD86 of Blymphocytes had been observed.The apoptosis of Tlymphocytes of 24weekold group was lower than that of 32weekold group.Twenty four hours proteinuria of NZBW F1 mice increased along with age.The renal pathology at 32weekold group were notably impaired. Conclusion： Compared with 32weekold group， the lymphocytes activation increased， apoptosis decreased in 24weekold group， and kidneys in 32week group were impaired significantly， which may be assoiated with their autoimmune stage.

　　［Key words］ lupus erythematosus； systemic； kidney； lymphocyte； apoptosis

　　人类系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种典型的自身免疫性疾病，以T，B淋巴细胞异常活化和自身抗体产生为主要特征，并有免疫复合物沉积在重要脏器引起系统性损害。NZBW F1小鼠是1963年Howie等［1］将新西兰黑鼠（NZB）和新西兰白鼠（NZW）杂交后1代小鼠，其父代NZW临床表现正常，母代NZB有自身免疫性贫血，但没有严重的肾小球肾炎。NZBW F1鼠发病近似于人类SLE，自发发病且与性激素有关，雌鼠发病早，且病情较重，雄鼠发病迟［2］。发病的NZBW F1鼠临床损害以肾炎表现为主，兼有其他脏器损害。我们以NZBW F1雌鼠为研究对象，检测24周龄和32周龄NZBW F1雌鼠的T，B淋巴细胞活化情况，T淋巴细胞凋亡及其肾脏病理改变，为狼疮鼠的进一步研究提供实验依据。

1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　SPF级NZBW F1雌鼠15只，20周龄，体质量（30±2）g，购自南京大学动物模式研究所，许可证号：SLXK(苏12005002)。

　　1.2 试剂与材料

　　刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）(Sigma公司)，DMEM培养粉（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），考马斯亮蓝尿蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），EZSepTMMouse淋巴细胞分离液（达科为生物技术有限公司），PE大鼠抗小鼠CD69/CD28/CD86抗体、FITC大鼠抗小鼠CD3/CD19及相应的同型对照抗体（eBioscience公司），AnnexinV/PI 凋亡试剂盒（美国BD公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

　　1.3 动物分组及处理

　　SPF级环境适应性饲养NZBW F1鼠2周，将其随机分为两组：24周龄组9只和32周龄组6只，每周用代谢笼收集24 h小鼠尿液，用考马斯亮蓝法测尿液的蛋白质含量，乘以尿液体积，即得出小鼠24 h尿蛋白量。分别在24周龄和32周龄时摘眼球处死小鼠，留取血清检测抗dsDNA抗体，并取一侧肾脏迅速置于盛有10%中性甲醛的小瓶中固定、脱水、石蜡包埋后切片，PAS染色观察病理改变。

　　1.4 NZBW F1鼠脾淋巴细胞的制备

　　无菌取NZBW F1鼠脾脏，在60 mm培养皿中放入4 ml淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上，用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使分散的单细胞透过尼龙网悬于淋巴细胞分离液中。将脾细胞悬液转移到离心管中，加入1 ml DMEM培养液，800 g离心30 min，取单个核细胞层经PBS洗涤后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，并置于37℃，5% CO2饱和湿度条件下培养90 min，收集悬浮细胞计数并制成5×106/ml细胞悬液。

　　1.5 不同周龄NZBW F1鼠T淋巴细胞活化情况

　　分别将24周龄和32周龄NZBW F1鼠脾细胞制成5×106/ml浓度，100 μl/孔加入96孔培养板中，用ConA(终浓度为5 μg/ml)刺激，每组复3孔，体系不足以培养液补足。收集培养24 h的两组细胞，与抗CD3，CD69抗体及相应的同型对照抗体反应后用流式细胞仪（FCM）检测，用cellQuest软件进行CD3+CD69+比例分析。收集培养72 h的两组细胞，与抗CD3，CD28抗体及相应的同型对照抗体反应后用FCM检测，用cellQuest软件分析CD3+CD28+比例。

　　1.6 不同周龄NZBW F1鼠B淋巴细胞活化情况

　　分别将24周龄和32周龄NZBW F1鼠脾淋巴细胞制成5×106/ml浓度，100 μl/孔加入96孔培养板中，用LPS(终浓度为25 μg/ml)刺激，每组复3孔，体系不足以培养液补足。收集培养24 h的两组细胞，与抗CD19，CD69抗体及相应的同型对照抗体反应后用FCM检测，用cellQuest软件进行CD19+CD69+比例分析；收集培养72 h的两组细胞与抗CD19，CD86抗体及相应的同型对照抗体反应上FCM检测，用cellQuest软件进行CD19+CD86+比例分析。

　　1.7 不同周龄NZBW F1鼠T淋巴细胞凋亡情况

　　细胞培养方法及分组同“1.5”。收集培养24 h的各组细胞按Annexin V/PI凋亡试剂盒说明书严格操作。用流式细胞仪检测24周龄和32周龄NZBW F1鼠T淋巴细胞的凋亡情况。

　　1.8 统计学处理

　　数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 13.0统计学软件处理，细胞活化百分率以平方根acrsin转换后数据分析，符合正态分布进行两样本t检验，P&<0.05表示差异有统计学意义。24 h尿蛋白量与周龄做相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 不同周龄NZBW F1鼠24 h尿蛋白量

　　24周龄鼠24 h尿蛋白量为(0.501±0.028) mg，26周的标准偏差最大，随鼠龄增加24 h尿蛋白量逐渐增加，到32周龄时达到高峰(10.873±1.243) mg。24 h尿蛋白量与小鼠周龄呈直线相关（r=0.981，P&<0.01）。直线回归方程的截距(a)=-30.535，回归系数(b)=1.280，见图1。

　　2.2 不同周龄NZBW F1鼠肾脏病理改变

　　24周龄时NZBW F1鼠肾脏病理以炎症细胞浸润为主，肾小球和肾小管大致正常。32周龄时则肾小球增生硬化，血管炎症细胞浸润，肾小管大量蛋白管型，部分肾小球系膜增生硬化。见图2。

　　2.3 不同周龄NZBW F1鼠T，B淋巴细胞活化情况

　　24周龄NZBW F1鼠T淋巴细胞CD69，CD28表达均高于32周龄组（P&<0.05）；32周龄组B细　　胞CD69表达较24周龄组下降（P&<0.05），CD86表达两组差异无统计学意义(P&>0.05)。见表1。表1 NZBW F1鼠T，B淋巴细胞活化情况

　　2.4 不同周龄NZBW F1鼠T淋巴细胞凋亡情况

　　24周龄鼠的T淋巴细胞凋亡率为（12.57±2.76）%，32周龄鼠T淋巴细胞凋亡率为（23.44±2.15）%，24周龄组凋亡率较32周龄组明显下降(P&<0.05)。见图3。

3 讨 论

　　NZBW F1鼠是常用的SLE动物模型之一，雌鼠一般于3～4月龄时起病，且病情与年龄呈正相关［3］，5～6月龄时IgG自身抗体和SLE临床表现同时出现，往往在8月龄起陆续死于肾功能衰竭，大部分在生后1年内死亡［4］。姜波等［5］认为18～24周狼疮鼠经血清抗核抗体和肾脏病理检测，具有典型的SLE临床特征。我们研究发现24周时主要存在血清学异常，表现为抗dsDNA抗体阳性，肾脏病理改变较轻，为发病早期；32周时明显发病，而且病情较重，肾脏严重受损，甚至出现死亡。病理学检查发现，32周龄比24周龄NZBW F1鼠肾脏损害严重得多。选择这2个年龄段进行观察，可以了解病情轻重之间的差异。此外观察到24 h尿蛋白量与小鼠周龄成正相关。

　　已知淋巴细胞表面CD69， CD28和 CD86的变化可反映T，B淋巴细胞的功能状态，其中 CD69可作为一个近期活化T，B淋巴细胞群的标志来检测和评估体内细胞介导的免疫反应水平［6］。CD28与CD80，CD86互为配体，提供共刺激信号使T细胞增殖［7，8］。Fujii等［9］发现NZBW F1雌鼠CD4+T细胞早期活化标记CD69升高与周龄相关，通过对NZBW F1×NZW回交鼠的多基因控制进行数量性状基因定位（QTLM）和联结分析，认为在12号染色体上某部位存在特定的Sta1(spontaneous Tcell activation)与MHC互相作用使得CD4+T细胞自身耐受性受损，促进了NZBW F1鼠的自身免疫异常。

　　我们研究发现NZBW F1鼠24周龄组与32周龄组相比，T淋巴细胞凋亡率下降，凋亡受抑制，淋巴细胞寿命延长，另外T淋巴细胞活化标记CD69，CD28表达增加，B淋巴细胞CD69表达也增加，CD86则无明显差异。24周龄时T，B淋巴细胞活化，多克隆激活，产生自身抗体（抗dsDNA抗体阳性），出现免疫异常及肾脏损害。32周龄时，T，B淋巴细胞活化标记下降和T淋巴细胞凋亡减少，可能与机体老化及病程晚期有关，具体机制有待进一步阐明。

参考文献

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