阿司匹林对胃癌细胞株SGC7901增殖及核因子κB表达的影响

　　　　　　 作者：姚红波 李永金 陶燕 黄晓佳 陈永昌

【摘要】 目的： 探讨阿司匹林对胃癌细胞SGC7901增殖及核因子κB p65（NFκB p65）表达的影响。方法： 培养胃癌细胞株SGC7901，采用MTT法检测阿司匹林在不同浓度和不同作用时间下对胃癌细胞增殖的影响；DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；蛋白质印迹法和免疫荧光法检测阿司匹林对胃癌细胞 NFκB p65表达的影响。结果： MTT结果显示，在0.1～10 mmol/L浓度区间内，随浓度增加和时间的延长，阿司匹林对SGC7901细胞的抑制率逐渐增加。SGC7901细胞经10 mmol/L阿司匹林作用6 h和12 h后，细胞发生凋亡。随着阿司匹林作用浓度增加和作用时间延长，胃癌细胞 NFκB p65的表达逐渐降低。结论： 阿司匹林对胃癌细胞SGC7901的增殖具有抑制作用，且与阿司匹林的浓度和作用时间呈正相关，其作用机制可能与通过抑制胃癌细胞NFκB p65的表达而使细胞发生凋亡有关。

【关键词】 胃癌细胞； 阿司匹林； 核因子κB； 细胞凋亡

　　［Abstract］ Objective: To investigate the effect of aspirin on proliferation and nuclear factor kappa B expression in gastric cancer cell line SGC7901. Methods： Gastric cancer cell line SGC7901 was treated with aspirin of different concentrations or different time， effect of aspirin on proliferation and apoptosis in SGC7901 was evaluated by MTT assay and DNA agarose gel electrophoresis; expression of nuclear factor kappa B p65 was determined by Western blotting and immumofluorescence method. Results： Aspirin can inhibit the proliferation of SGC7901 among concentrations of 0.1～10 mmol/L. As the dose and time increased， the inhibitory of aspirin on proliferation of SGC7901 was significantly increased. Apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis after treating with aspirin of 10 mmol/L for 6 or 12 hours. Aspirin reduced expression of NFκB p65 in a concentration and time dependent pattern. Conclusion： Aspirin inhibited proliferation of gastric cancer cell line SGC7901; the inhibition of NFκB p65 expression inducing cellular apoptosis may ascribed to mechanism of antiproliferation activity of aspirin.

　　［Key words］ gastric cancer cell; aspirin; NFκB p65; apoptosis

　　近年来研究表明，阿司匹林对胃肠道肿瘤具有预防作用［1］，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制包括多个方面但并不很明确。过去大量研究显示，阿司匹林通过抑制环加氧酶2（COX2）活性，下调COX2的表达而发挥抗肿瘤效应［2］。但目前很多研究提示，阿司匹林能通过非COX2依赖性途径发挥抗肿瘤作用。核因子κB（NFκB）信号通路便是其中之一。NFκB是细胞中的重要转录因子，在受到各种激活因子如肿瘤坏死因子（TNF）刺激时，NFκB与抑制分子IκB解离而被活化，p50p65二聚体进入细胞核发挥基因调控作用［3，4］。本实验通过MTT法， DNA的琼脂糖凝胶电泳以及蛋白质印迹法，研究阿司匹林对胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用和对NFκB p65表达的影响，初步探讨其抑瘤机制。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　人胃癌细胞株SGC7901由中科院上海细胞生物研究所提供。小牛血清（兰州民海生物），DMEM（Gibco公司）。NFκB p65抗体（碧云天生物技术研究所），羊抗兔IgG（中杉公司），FITC antirabbit IgG（Santa Cruze公司）。阿司匹林（Sigma公司）。酶标仪为BioRad 公司产品。

　　1.2 细胞培养

　　人胃癌细胞株SGC7901用含10%小牛血清的DMEM培养，置于37℃，5% CO2的孵育箱中培养。待细胞铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化成单细胞，传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.3 MTT实验

　　取对数生长期的SGC7901细胞，用上述消化液消化后制成单细胞悬液，记数，调整细胞密度为4×104/ml，接种于96孔培养板上，每孔200 μl（每孔8 000个），取不含细胞的培养液作空白调零。细胞继续培养24 h后，各孔分别加入终浓度为0.1，1，5，10 mmol/L的阿司匹林，以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照，各组设3个复孔。分别培养24，48，72 h后，各孔加入0.5%的MTT 20 μl，继续培养4 h，吸除孔内液体，各孔加入150 μl DMSO，震荡10 min后，用酶标仪在570 nm波长处测光密度（D）值，并计算阿司匹林对SGC7901细胞的抑制率，抑制率=（1-实验组D均值/对照组D均值）×100%。该实验重复3次。

　　1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡

　　1.4.1 DNA提取 取对数生长期的SGC7901细胞接种于6孔板内，以终浓度为10 mmol/L的阿司匹林分别作用6，12，24 h；收集细胞至EP管中，加入DNA提取缓冲液进行提取，将最终收集的DNA沉淀溶于适量灭菌水中。

　　1.4.2 电泳 取5 μl DNA样品，加入0.5 μl上样缓冲液，混匀后用1%的琼脂糖凝胶在100 V，10 mA条件下电泳1 h。在紫外灯下进行观察。

　　1.5 蛋白质印迹法检测NFκB p65的表达

　　1.5.1 核蛋白的提取 细胞接种和处理同“1.4”。用预冷的PBS洗2次，将细胞刮下移至EP管中，4℃离心5 min收集细胞。各EP管中细胞经缓冲液A，PMSF，缓冲液B作用后提取到核蛋白。将蛋白样品与2×上样缓冲液混匀，煮沸5 min，-20℃保存备用。

　　1.5.2 蛋白质印迹 10%的SDSPAGE，各泳道上样量为8 μl，先80 V电泳20 min，然后以100 V电泳1.5 h分离蛋白样品。

　　1.5.3 电转膜 4℃，90 mA恒流转膜过夜。转好后取出PVDF膜，在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。

　　1.5.4 与抗体反应 将膜与1∶500稀释的NFκB p65抗体4℃孵育过夜，用TBST漂洗3次，每次5 min。加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），室温下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。用ECL发光剂显示阳性条带，在Typhoon分子成像系统上扫描结果，用软件测得NFκB p65和GAPDH条带的灰度值，将两者的比值作为半定量结果（相对值），作出直方图。并进行统计学分析。

　　1.6 免疫荧光法检测NFκB p65的表达

　　将SGC7901细胞接种在置于24孔细胞培养板中的盖玻片上，密度为30％左右，培养24 h后加入不同终浓度的阿司匹林，继续培养24 h。细胞用新配的4%低聚甲醛固定4℃过夜，PBS洗3遍；用0.3%的TritonX100作用8 min以使细胞膜通透性增加；加3%BSA室温孵育1 h以封闭非特异结合位点；与1∶500稀释的NFκB p65抗体4℃孵育过夜；加入FITC标记的二抗，室温孵育1 h。以上每步操作后均用PBS洗3遍。用甘油封片后于荧光显微镜下观察结果。

　　1.7 统计分析

　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS11.5软件对数据进行处理，采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

　　2.1 阿司匹林对SGC7901细胞株增殖的影响

　　表1结果所示为SGC7901细胞株经阿司匹林作用后测得的光密度值，在同一时间组，随着阿司匹林作用浓度增加，测得的光密度值逐渐减小。由图1可见，在同一阿司匹林浓度作用组，随着阿司匹林作用时间的延长，其对SGC7901细胞株增殖的抑制率逐渐增加；在阿司匹林作用时间相同的情况下，其对SGC7901细胞株增殖的抑制率随作用浓度增加而增加，具有明显的量效和时效关系(P&<0.05，P&<0.01)。表1 SGC7901细胞经阿司匹林作用后的D值变化

　　2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳结果

　　DNA凝胶电泳图谱呈现“梯子状”断裂现象是细胞凋亡的一个重要标志。SGC7901细胞经10 mmol/L的阿司匹林作用6 h和12 h后，出现了DNA ladder，说明阿司匹林作用6 h和12 h后诱导细胞凋亡，随着作用时间延长到24 h则成“涂片”状，说明出现了细胞坏死现象。见图2。

　　2.3 阿司匹林对SGC7901细胞NFκB p65表达的影响

　　不同浓度阿司匹林与SGC7901细胞作用24 h，以及10 mmol/L的阿司匹林与SGC7901作用不同时间后，分别提取核蛋白，通过蛋白质印迹法检测NFκB p65在核内的表达情况。图3，图4结果显示，阿司匹林能降低NFκB p65在核内的表达，且随着阿司匹林作用浓度的增加和作用时间的延长，其表达明显降低(P&<0.05， P&<0.01)。

　　2.4 免疫荧光法检测NFκB p65的表达

　　图5免疫荧光检测结果显示，SGC7901细胞的胞核可见绿色荧光，随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长，荧光强度逐渐减弱，在10 mmol/L的阿司匹林作用组，基本看不到荧光。图6结果显示，随着阿司匹林作用时间的延长，荧光强度逐渐减弱。10 mmol/L阿司匹林作用达24 h时，NFκB p65在核内的表达已非常低。

3 讨 论

　　阿司匹林是广泛使用的非甾体类抗炎药，研究表明［5］，长期服用阿司匹林的人群结肠癌的发病率较普通人群明显降低。流行病学研究也显示，阿司匹林可减少胃癌发生的危险，并延长胃癌患者的存活期。我们通过MTT实验证实，阿司匹林对胃癌细胞SGC7901增殖有明显的抑制作用，其抑制率随着阿司匹林作用浓度的增加和作用时间的延长而增加，具有较好的量效和时效关系。本次实验还发现，阿司匹林能降低SGC7901细胞NFκB p65的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖。

　　阿司匹林抑制胃肠道肿瘤的作用机制尚不十分明确。过去大量研究显示，阿司匹林能抑制COX2活性，下调COX2的表达，通过抑制COX2自身作用或抑制PGE2的合成而发挥抗肿瘤效应。目前，信号传导通路成为阿司匹林抑瘤机制中的研究热点。NFκB信号通路便是其中之一。NFκB是由多肽链p50和p65两个亚基组成的同源或异源二聚体，其中主要发挥生理作用的是p50p65异源二聚体。NFκB在炎症、细胞增殖和凋亡中是一种关键性的转录调节因子［6］。NFκB在胞质中以两种无活性的形式存在，在受到TNF等刺激时，NFκB与抑制分子IκB解离，导致IκB 的磷酸化和泛素化继而被降解，p50p65二聚体发生核转位而发挥基因调控作用，其活化通常与细胞凋亡有关［7］，通过激活抗凋亡基因和其他靶基因而发挥抗凋亡作用。研究证实，NFκB在肿瘤组织中呈异常活性表达［8］。本实验表明，阿司匹林能抑制SGC7901细胞NFκB活化，降低细胞核内NFκB p65表达，从而拮抗NFκB的抗凋亡作用。其机制可能通过与IκB激酶β(IKKβ)特异性结合，阻止IκB磷酸化和降解，从而抑制NFκB p65活化；也可能直接通过抑制NFκB p65核转位，而与IKKβ活性和IκB 基因转录无关。此外，阿司匹林诱导胃癌细胞凋亡是其抗肿瘤效应的一个非常重要的机制， 很多研究都表明阿司匹林有抑制胃癌细胞生长， 促进胃癌细胞凋亡的作用。本实验通过DNA琼脂糖凝胶电泳显示，SGC7901细胞经10 mmol/L阿司匹林作用不同时间后，在6 h　　和12 h时可见凋亡条带，提示促进肿瘤细胞凋亡为阿司匹林抑制SGC7901细胞增殖的机制之一。

　　鉴于阿司匹林对胃癌细胞具有抑制作用，并能延长胃癌患者的生存期，临床可将其作为预防性用药以降低胃癌的发病率，也可将其用于早期胃癌患者以降低病死率。目前，阿司匹林经COX2途径抑制胃癌细胞增殖研究的较为清楚，而有关信号传导方面的机制尚不十分明确。通过本次实验我们还可推测阿司匹林还可能通过凋亡以外的途径对肿瘤细胞增殖产生抑制作用，这将在以后进一步深入研究。针对阿司匹林对胃癌发生的信号传导途径具有抑制作用，我们可为胃癌的治疗确定一些新的靶位，为胃癌的药物治疗和基因治疗提供新的手段。

参考文献

［1］ Husain SS， Szabo IL， Tamawski AS. NSAID inhibition of GI cancer growth: clinical implications and molecular mechanisms of action［J］. Am J Gastroenterol， 2002， 97(3): 542-553.

［2］ Kim KY， Seol JY， Jeon GA， et al.The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl2 and caspase3 in human cervical cancer cell［J］.Cancer Lett， 2003，189(2):157-166.

［3］ Escárcega RO， FuentesAlexandro S， GarcíaCarrasco M， et al. The transcription factor nuclear factorkappa B and cancer［J］. Clin Oncol， 2007， 19(2): 154-161.

［4］ Hayden MS， Ghosh S. Shared principles in NFκB signaling［J］. Cell， 2008， 132(3): 344-362.

［5］ Chan AT， Giovannucci EL， Meyerhardt JA， et al. Longterm use of aspirin and nonsteroidal antiinflammatory drugs and risk of colorectal cancer［J］. JAMA， 2005， 294(8): 914-923.

［6］ Ali S， Mann DA. Signal transduction via the NFκB pathway: a targeted treatment modality for infection， inflammation and repair［J］. Cell Boichem Funct， 2004， 22(2): 67-79.

［7］ Redlak MJ， Power JJ， Miller TA. Apoptosis by aspirin: roles of NFκB and PKC signaling［J］. J Surg Res， 2008， 145(1): 66-73.

［8］ 翟水龙，孙 浩，秦燕明，等. 核因子κB和VEGF在肾癌中的表达及其意义［J］. 江苏大学学报：医学版， 2008， 18(1): 64-66.