小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

　　　　作者：鲍俊峰， 王胜军， 马洁， 崔大伟， 杨先知， 毛朝明， 仝佳， 邵启祥， 许化溪

【摘要】 目的： 体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多克隆抗体。方法： 从质粒Foxp3pMD18T扩增小鼠Foxp3 全长基因，亚克隆至原核表达载体pET32a，转化E.coli BL21； IPTG诱导表达目的蛋白，Ni2+NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果： 成功构建了Foxp3pET32a原核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体效价为1∶20 000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论： 成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。

【关键词】 Foxp3； 原核表达； 多克隆抗体； 小鼠

　　［Abstract］ Objective: To prepare rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein by prokaryotic expression of mouse Foxp3 protein in vitro. Methods： Foxp3 gene was amplified by PCR from the full length plasmid Foxp3pMD18T and subcloned into the pET32a vector; the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and the expression of recombinant protein was induced by IPTG. after purified with Ni2+NTA column， identification of the recombinant protein by Western blot was performed; the purified protein was used as antigen to immunize rabbits， the titer and the specificity of the rabbit antiFoxp3 antibody were detected by ELISA and Western blot， respectively. Results： The prokaryotic expression vector for Foxp3pET32a was constructed successfully; mouse Foxp3 protein had been expressed and purified; rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein was prepared， the titer of the antibody was 1∶20 000 by ELISA and Western blot analysis showed that the polyclonal antibody could specifically recognize mouse Foxp3 protein. Conclusion： Mouse Foxp3 protein had been expressed and rabbit antiFoxp3 antibody had been prepared successfully.

　　［Key words］ Foxp3; prokaryotic expression; polyclonal antibody; mouse

　　FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子家族，通常和细胞生长发育的调控有关［1］。Foxp3蛋白是叉头样转录因子家族中的成员， 2001年由Brunkow等［2］首次报道。小鼠Foxp3基因位于其X染色体，全长为3 739 bp(包含5′端非编码的外显子)，其基因编码的蛋白质也称为Scurfy，由429个氨基酸组成，N末端有锌指蛋白、亮氨酸拉链和一个富含脯氨酸的区域，而叉头样DNA 结合域与其他FOX成员不同，靠近蛋白C末端［3］。Foxp3在小鼠特异性表达于CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cells， Treg细胞)而不表达于CD8+T细胞，研究发现，Foxp3作为Treg细胞发育的一个关键转录因子，它的表达及功能与Treg细胞密切相关［4］，可以更好地在分子水平上了解Treg细胞。
　　
　　本实验室已经构建小鼠Foxp3/AAV表达载体［5］，在此基础上我们构建原核表达载体Foxp3pET32a，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。利用纯化的Foxp3蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，为研究小鼠Foxp3蛋白对Treg细胞的功能影响提供基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、dNTP，T4DNA连接酶、蛋白标准参照物、DNA标准参照物、限制性核酸内切酶EcoR I，Sal I购自Takara公司；Profinity IMAC Nickel柱购自BioRad公司；ECL检测试剂盒购自GE公司；抗小鼠Foxp3单克隆抗体购自eBioscience公司；羊抗大鼠HRPIgG、羊抗兔HRPIgG购自上海普飞公司；IPTG、弗氏佐剂购自Sigma公司；家兔购自江苏大学动物中心。

　　1.1.2 质粒载体和菌株 原核表达载体pET32a、感受态细菌E.coli BL21由本室保存；质粒mFoxp3 pMD18T由本室克隆并保存。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 重组表达质粒Foxp3pET32a的构建 以质粒Foxp3pMD18T作为模板，PCR扩增获得Foxp3基因的PCR产物， EcoR I，Sal I双酶切PCR产物和载体质粒pET32a， 胶回收， T4DNA连接酶16℃过夜，连接两者的黏性末端，连接产物用热休克法转化感受态BL21菌，涂板，挑取单个菌落至3 ml LB培养基(含50 μg/ml氨苄西林)中， 37℃摇菌过夜。抽提质粒DNA，进行质粒PCR和酶切鉴定，阳性质粒进行测序。

　　1.2.2 Foxp3重组蛋白的诱导表达及鉴定 挑取鉴定正确的Foxp3pET32a重组质粒单个菌落，接种于3 ml LB 培养基(含50 μg/ml氨苄西林)中，37℃，250 r/min振荡培养12 h，以1∶100的比例将菌液接种于5 ml LB培养基中，37℃摇菌至D（600 nm）=0.6～0.8 时加入终浓度0.5，1.0，1.5 mmol/L IPTG，于30℃或37℃在0，2，4，6 h分别进行诱导表达，以4℃，5 000 g离心10 min收集菌体，用1/10体积的冷PBS重悬细菌，加入100 μg/ml的溶菌酶，冰浴超声破菌，4℃，12 000 g离心20 min，各取上清和沉淀行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。

　　1.2.3 重组蛋白的蛋白质印迹鉴定 将表达蛋白行SDSPAGE电泳后，直接电转至PDVF膜上(恒流90 mA，4℃，5 h)，5%脱脂奶粉封闭，TBST缓冲液漂洗，滴加1∶2 000稀释的Foxp3单克隆抗体作用2 h，漂洗，加1∶10 000稀释的兔抗大鼠 HRPIgG二抗作用30 min，漂洗。用ECL检测试剂为底物，曝光X底片，显色，定影。

　　1.2.4 Foxp3重组蛋白的纯化 扩大培养重组表达菌，大量诱导表达蛋白，Profinity IMAC Nickel柱纯化蛋白(按蛋白纯化试剂盒操作说明书进行)，简要操作如下：8 mol/L尿素、5 mmol/L咪唑结合缓冲液溶解包涵体，8 mol/L尿素、10 mmol/L咪唑洗涤缓冲液去除非特异蛋白，用梯度浓度的复性缓冲液(尿素8 mol/L 至0 mol/L)直接在纯化柱上复性包涵体重组蛋白，然后再用梯度浓度(咪唑10 mmol/L至500 mmol/L)的复性洗脱缓冲液洗脱重组蛋白，取得纯化的Foxp3重组蛋白，以SDSPAGE分析检测蛋白的纯度，蛋白质印迹检测蛋白的特异，Bradford法测定纯化蛋白的浓度， 4℃保存备用。

　　1.2.5 免疫动物 将纯化的Foxp3蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂（第一次为完全佐剂，以后为不完全佐剂）充分乳化后，注射家兔进行免疫。主要程序如下：首先在兔双脚垫分别注射弗氏完全佐剂1 ml，两周后再在颈背部皮下注射弗氏不完全佐剂1 ml，然后每隔一周注射弗氏不完全佐剂进行加强免疫，取血前ELISA法测定抗血清的效价，达到理想效价处死家兔，收集血清，4℃保存备用。

　　1.2.6 兔抗小鼠Foxp3多克隆抗体效价和特异性的测定 多克隆抗体效价用ELISA法检测，抗原为纯化的小鼠Foxp3重组蛋白，一抗为不同浓度稀释的兔血清，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000稀释)，邻苯二胺(OPD)显色，酶标仪测定光密度。抗体特异性用蛋白质印迹鉴定，一抗为1∶2 000稀释的多抗血清，二抗为1∶10 000稀释的羊抗兔HRPIgG。

　　2 结果

　　2.1 重组表达质粒Foxp3pET32a的构建及鉴定
　　
　　以质粒Foxp3pMD18T作为模板，PCR扩增小鼠Foxp3基因，在1 287 bp处可见单一条带，与目的片段大小相符（图1）。将Foxp3亚克隆到原核表达载体pET32a多克隆位点中，重组克隆经酶切鉴定，目的片段大小与预期相符(图2)。测序结果显示目标序列与NCBI(加入号: NM_054039)相应序列完全相符(结果未显示)，证实表达载体构建成功。
　　
　　1：DL2000标记; 2：PCR扩增产物

　　图1 小鼠Foxp3基因的PCR扩增产物（略）

　　Fig 1 Amplification of cDNA fragment of mouse　Foxp3 by PCR

　　1：DL2000标记; 2：EcoR I和Sal I双酶切质粒Foxp3pET32a; 3：DL15000标记

　　图2 重组载体的酶切鉴定（略）

　　Fig 2 Analysis of the recombinant vector by　restriction enzyme digestion

　　2.2 重组小鼠Foxp3蛋白的诱导表达，纯化及鉴定
　　
　　Foxp3pET32a阳性菌株经IPTG诱导后收集细菌，SDSPAGE电泳显示在30℃，1 mmol/L IPTG诱导4 h条件下，融合蛋白表达达到高峰，蛋白条带位于约62 kD处，与预期相符，用抗Foxp3单克隆抗体进行蛋白质印迹鉴定显示，在约62 kD的位置出现单一条带，证实该蛋白条带为Foxp3融合蛋白。该重组蛋白主要以包涵体形式存在，用Profinity IMAC Nickel柱进行纯化蛋白，蛋白纯化扫描证实蛋白纯度在90%以上，Bradford法测定蛋白浓度约为1 mg/ml（图3）。我们在此条件下大量诱导Foxp3pET32a阳性菌，收集菌液500 ml， 获得干菌16.5 g，经纯化后获得Foxp3融合蛋白约10 mg。

　　1:蛋白标记; 2:Foxp3pET32a/ BL21经IPTG诱导4 h; 3:Foxp3pET32a/ BL21经IPTG诱导2 h; 4:pET32a/ BL21经IPTG诱导2 h; 5:纯化后Foxp3 融合蛋白; 6:蛋白质印迹鉴定Foxp3融合蛋白

　　图3 Foxp3融合蛋白的表达、纯化及鉴定（略）

　　Fig 3 Expression，purification and identification　of Foxp3 fusion protein

　　2.3 兔抗小鼠Foxp3多克隆抗体效价和特异性的测定
　　
　　以免疫前兔血清作为阴性对照，ELISA法测定抗体效价，以P/N＞2.1为判断指标，抗体滴度达到1∶20 000；蛋白质印迹分析显示，多克隆抗体可单一结合重组小鼠Foxp3蛋白，与其他菌体蛋白无交叉反应（图4）。
　　
　　1：蛋白标记; 2：对照蛋白; 3：Foxp3 融合蛋白

　　图4 抗体特异性的Western blot分析（略）

　　Fig 4 Analysis of antibody specificity by Western blot

　　3 讨论
　　
　　CD4+CD25+T 细胞是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一，在稳定的自身免疫环境中发挥重要的作用［6］。但有关CD4+CD25+T 细胞分化发育的具体机制尚不清楚。Hori等［7］在Science上阐述了Foxp3(forkhead box P3)与CD4+CD25+Treg细胞的关系，Foxp3特异性地表达于CD4+CD25+Treg细胞上，并在该细胞的发育和功能维持中起很重要的作用［8，9］，进而提示Foxp3可能是CD4+CD25+Treg细胞的一个特征性标志［10］。
　　
　　本研究选用了T7表达系统中的原核表达载体pET32a，pET系列载体以T7为启动子，可使目的基因得到高效转录与翻译，同时它所表达的蛋白产物在N 末端带有6个连续的组氨酸，蛋白产物可通过亲和层析快速、简便地纯化。同时在诱导表达重组蛋白，IPTG浓度，诱导温度及时间均会影响融合蛋白的产量，我们最终选择在30℃，1 mmol/L IPTG 4 h来诱导表达蛋白，使获得融合蛋白的产量达到最高。取得纯化效果好的蛋白抗原是制备抗体实验成功与否的关键，我们使用Profinity IMAC Nickel柱进行纯化蛋白，原理是通过纯化柱中树脂的固化Ni2+与融合蛋白带有的多聚组氨酸结合，形成金属螯合物，再用咪唑竞争性结合固化Ni2+，从而达到洗脱蛋白的目的。金属螯合层析具有高效、高容量、快速、强力浓缩等特点，纯化后获得的蛋白经扫描证实蛋白纯度在90%以上，这为最终获得特异性的抗体提供保证。接下来有关Foxp3在CD4+CD25+Treg细胞的信号传导中如何发挥作用还需要进行很多工作，制备Foxp3纯化抗原及其多克隆抗体对CD4+CD25+T细胞的发育和免疫调节功能的研究提供了良好的实验基础。

　

参考文献

　　［1］ Coffer PJ， Burgering BM. Forkheadbox transcription factors and their role in the immune system［J］. Nat Rev Immunol， 2004， 4(11): 889-899.

　　［2］ Brunkow ME， Jeffery EW， Hjerrild KA， et al. Disruption of a new forkhead/wingedhelix protein， scurfin， results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse［J］. Nat Genet， 2001， 27(1): 68-73.

　　［3］ Carlsson P， Mahlapuu M. Forkhead transcription factors: key players in development and metabolism［J］. Dev Biol， 2002， 250(1 ): 1-23.

　　［4］ Hori S， Sakaguchi S. Foxp3: a critical regulator of the development and function of regulatory T cells［J］. Microbes Infect， 2004， 6(8): 745-751.

　　［5］ 王胜军，许化溪，钱 晖，等.重组Foxp3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25-T细胞的实验研究［J］.中国免疫学杂志，2006，22（4）：291-293.

　　［6］ Tang Q， Bluestone JA. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades， master of regulation［J］. Nat Immunol，2008，9(3):239-244.

　　［7］ Hori S， Nomura T， Sakaguchi S， et al. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］. Science， 2003， 299(5609): 1057-1061.

　　［8］ Zhang L， Zhao Y. The regulation of Foxp3 expression in regulatory CD4(+)CD25(+)T cells: multiple pathways on the road［J］. J Cell Physiol，2007，211(3): 590-597.

　　［9］ Marson A，Kretschmer K， Frampton GM，et al.Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during Tcell stimulation［J］. Nature，2007，445(7130): 931-935.

　　［10］ Fontenot JD， Gavin MA， Rudensky AY，et al. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells［J］. Nat Immunol， 2003， 4(4) :330-336.