蝙蝠葛酚性碱对脑缺血大鼠细胞凋亡相关蛋白PKB表达的影响

　　　　 作者：杜永强， 白云， 赵大卓， 姜波， 苏云明

【摘要】 目的： 探讨蝙蝠葛酚性碱（phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD）预处理对脑缺血后大脑皮质细胞凋亡蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)表达的影响。方法： 采用线栓阻塞大脑中动脉方法制备大鼠脑缺血模型，并用受试药物术前连续预处理模型大鼠7 d。采用免疫组织化学方法测定假手术组，模型组，PAMD高、中、低剂量组，尼莫地平、银杏叶片预处理组大鼠缺血后24，48，72 h大脑皮质中细胞凋亡相关蛋白PKB表达变化。结果： 行大脑中动脉闭塞后大鼠大脑皮质PKB均被诱导表达，PAMD预处理7 d后，缺血后各时间点大鼠大脑皮质PKB表达明显升高。结论： PAMD能明显促进缺血脑损伤后抑制细胞凋亡相关蛋白PKB表达水平，从而在缺血性脑损伤中起到神经保护作用。

【关键词】 脑缺血； 蝙蝠葛酚性碱； 细胞凋亡； 蛋白激酶B

　　［Abstract］ Objective: Study and explore the express of gene and protein of protein kinase B(PKB) about cerebral ischemia effects of phenolic alkaloids from Menispermum dauricum（PAMD）on cerebral ischemia in rats. Methods： In order to observe the neuroprotective effect of PAMD on cerebral ischemia， the rats with incomplete cerebral ischemia were induced with fishing lines in the middle cerebral artery (MCA) and then were executed at 24， 48 and 72 h after cerebral ischemia. The effects of PAMD on protein expression of PKB was detected with immunohistochemical method. Results： The PKB was induced express after MCAO of cerebral cortex in rats. The express of PKB was increased sharply at each time after executed by PAMD for 7 days. Conclusion： PAMD promoted the express of cell apoptosis protein PKB with cerebral ischemia injured and had protecting effect on cerebral ischemia.

　　［Key words］ cerebral ischemia；phenolic alkaloids from Menispermum dauricum；cell apoptosis；protein kinase B

　　脑血管病（CVD）是中老年人的常见病、多发病、疑难病，以其高发病率、高致残率、高死亡率受到国内外重视，成为中西药物治疗研究的热点领域。脑血管疾病中，缺血性脑血管病（ICVD）占了大部分，严重危害着人类的健康。脑缺血后神经元的死亡包括坏死和凋亡两种方式，脑功能的损伤程度与缺血程度及时间呈正相关，严重缺血的中心区以坏死为主，周边区(半暗带)的迟发性神经元死亡(delayed neuronal death， DND)则以凋亡为主［1］。自1991年蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)被克隆以来，虽然PKB的研究工作己经展开，但仍有许多问题尚未阐明。PKB在细胞生长、代谢、凋亡中扮演了很重要的角色［2］。PKB研究的另一个方向就是以它作为分子基础，寻找治疗糖尿病、恶性肿瘤、神经退行性疾病的药物［3，4］。

　　蝙蝠葛酚性碱（phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD）是从中药北豆根中提取的多种脂溶性生物碱的混合物，主要含有蝙蝠葛碱（dauricine，Dau）和蝙蝠葛苏林碱（daurisoline，DS），其他成分含量甚微。近年来，对PAMD的药理作用及其机制进行的大量研究，主要集中在对心血管系统的作用、对脑缺血及缺血再灌注损伤的保护作用、抗肿瘤等作用研究上。本研究建立大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型，通过观察PAMD对细胞凋亡相关蛋白PKB表达的影响来阐明其对ICVD的预防作用，为临床进一步阐明脑缺血损伤的机制和保护脑组织奠定基础，同时也为PAMD的新药开发及临床应用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

　　1.1 药品及主要试剂

　　PAMD由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，用时先以1 mol/L　HCl溶解后，再用1 mol/L　NaOH调pH值至中性，加蒸馏水至所需浓度。尼莫地平片(西安博爱制药有限公司，批号：国药准字H61020545)；银杏叶片(唐山荣大药业有限公司，批号：国药准字Z20027958)；12.5 Ｕ/μl肝素（上海生化）；水合氯醛（昆山）；低聚甲醛（天津）。

　　1.2 仪器设备

　　YT6生物组织摊烤片机（湖北）；生物组织包埋机（湖北孝感）；DGX9143B1电热鼓风干燥箱（上海福玛）；光学显微镜（Olympus Japan BH2）；Q500IW图像分析仪（德国Leica）。

　　1.3 实验动物

　　清洁级健康雄性Wistar大鼠200只，体质量（300±20）ｇ，鼠龄4～5个月，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。动物许可证号：黑动字P00101006。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 动物分组及给药方法 将大鼠适应性喂养7 d， 随机分成PAMD高、中、低剂量组，西药阳性对照组，中药阳性对照组，模型对照组及假手术组。PAMD高剂量组100 mg/kg、中剂量组50 mg/kg、低剂量组25 mg/kg，西药阳性对照组给予尼莫地平21.6 mg/kg，中药阳性对照组给予银杏叶片135 mg/kg，模型对照组及假手术组给予等容积生理盐水，各组均灌胃给药，每日1次，连续7 d，末次给药后30 min制备MCAO模型。

　　1.4.2 MCAO模型制备 采用稍加改良的Longa方法［5］，将Wistar大鼠制备为MCAO模型。操作方法简述如下：①单纱尼龙线，直径0.18～0.20 mm，长2.5 cm，在乙醇灯火焰旁，使其一头端形成光滑圆球状，经紫外线照射消毒后备用。②用10%水合氯醛350 mg/kg体质量腹腔注射麻醉大鼠。③将大鼠四肢固定于手术台上，颈部备皮，常规消毒铺洞巾。④行颈部正中切口，逐层分离并显露右侧颈总动脉(CCA)，小心分离右侧CCA，颈内动脉(ICA)，颈外动脉(ECA)，避免刺激迷走神经。⑤在CCA，ICA，ECA上各置一根30丝线。在距ICA、ECA分叉5 mm处结扎CCA，在ECA根部结扎ECA。⑥提拉预置在ICA上的丝线，将ICA血流阻断，在距ICA、ECA分叉5 mm的CCA上剪一“V”形切口。⑦将尼龙线烤钝的一端插入CCA上的小口，放松ICA上预置的丝线，将尼龙线经CCA插入ICA内，向前徐进18～20 mm，稍遇阻力即停止徐进。⑧将预置在ICA上的丝线扎紧，防止出血和栓子滑出。⑨缝合皮肤，术毕。术中大鼠出现呼吸困难、出血过多者弃之。MCAO术后(大鼠意识恢复后30 min)对脑缺血大鼠神经功能缺陷进行评分，计分在1～3分以上者纳入研究。

　　1.4.3 脑组织PKB蛋白含量测定 行为学检测完毕后，10％水合氯醛麻醉（350 mg/kg），快速开胸显露心脏，剪开右心耳，经左心室插管至升主动脉内，于5 min内快速灌注150 ml左右肝素化生理盐水，随后滴注含4%低聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液200 ml，缓慢灌注并固定。灌注完毕，从枕骨大孔剪开，完整取脑，在相同固定液中4℃固定不超过48 h。而后制作病理组织片；以PV6001二步法操作，终止反应后，苏木精复染，清水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片观察。

　　1.4.4 图像分析 阳性细胞数计数方法：400倍光镜下在缺血梗死灶周边区皮质选择5个不重叠的视场，计数阳性染色的细胞数，取其平均值。

　　1.4.5 统计学分析 结果采用SPSS11.5 for Windows统计软件分析处理，采用t检验。所得数据以均数±标准差(±s)表示。

2 结 果

　　PAMD对MCAO模型大鼠大脑皮质PKB蛋白表达的影响实验结果见表1，图1。表1 蝙蝠葛酚性碱对脑组织PKB蛋白含量的影响实验观察24，48及72　h 3个时间点PAMD对MCAO模型大鼠大脑皮质PKB蛋白表达的影响，结果显示在各时间点中，模型对照组与假手术组比较，PKB蛋白表达均有增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。同时PAMD高、中、低剂量组及尼莫地平对照组、银杏叶片对照组分别与各时间点对应的模型对照组比较，PKB蛋白表达均有不同程度的增加，其中术后24 h时间点PAMD中剂量组、西药阳性对照组、中药阳性对照组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后48 h及72 h时间点PAMD高、中剂量组及尼莫地平对照组、银杏叶片对照组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。除假手术组外，各组随时间变化PKB蛋白表达均有上升的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

　　PKB又称Akt［6］，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过PI3K激活。PI3K可使Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化，激活后的Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗细胞凋亡、促细胞生存功能。

　　目前研究表明，磷酸化后的Akt可通过作用于BAD，Caspase9，GSK3，CREB和Forkhead转录因子、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等底物或下游环节而促进细胞生存。研究发现，在短暂性全脑缺血早期阶段，缺血损伤相对较轻的部位如大脑皮质区磷酸化Akt表达增高。这种脑缺血早期Akt的激活是机体对脑缺血的一种保护性反应，与促进细胞存活有关。Yano等［7］在沙土鼠全脑缺血模型中，发现2 min脑缺血预处理能明显增加磷酸化Akt的核表达，并且持续至脑缺血再灌注后7 d，提示Akt的磷酸化激活参与脑缺血耐受机制的形成。但到目前为止，尚没有关于永久性大脑中动脉阻塞大鼠PKB蛋白表达的报道。

　　本实验采用免疫组织化学法，观察MCAO模型大鼠大脑皮质PKB蛋白表达的动态变化，结果显示，假手术组PKB蛋白表达较少而模型对照组PKB蛋白表达量增多，提示局灶性脑缺血可以诱导其表达。PAMD各治疗组PKB蛋白表达较模型对照组又有不同程度的增加，提示PAMD对于大鼠局灶脑缺血损伤后PKB蛋白的表达有促进作用，可能是其抗神经损伤的作用机制之一。PKB主要表达在神经元、星形胶质细胞、胶质细胞的胞质，少量表达在胞核，在缺血侧脑皮层、基底节、及脑缺血半暗带区表达明显增强，而对侧脑半球也有大量表达。随着缺血时间的延长，PKB蛋白阳性细胞有逐渐增多的趋势，于72 h达到高峰。本研究显示PAMD通过促进凋亡抑制蛋白PKB的表达对脑缺血早期的损伤起到保护作用。

参考文献

［1］ Datta SR，Brunet A，Greenberg ME，et al.Cellular survival:a play in three Akts［J］.Genes Dev，1999，13(22):2905-2927.

［2］ 周 颖，王 建，贺福初.蛋白激酶B(PKB/Akt)的结构、调控与功能［J］.生命的化学，2006，26（3）：226-228.

［3］ Hill MM，Hemmings BA.Inhibition of protein kinase B/Akt implications for cancer therapy［J］.Pharmacol Ther，2002，93(2):243-251.

［4］ Li Q，Zhu GD，Targeting serine/threonine protein kinase B/Akt and cellcycle check point kinases for treating cancer［J］.Curr Top Med Chem，2002，2(9):939-971.

［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et a1.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989.20(1):84-91.

［6］ Gao F，Gao E，Yue TL.Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemiareperfusion: the roles of PI3kinase，Akt and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation［J］.Circulation，2002， 105(12):1479-1502.

［7］ Yano S，Morioka M，Fukunaga K，et al.Activation of Akt/protein kinase B contributes to induction of ischemic tolerance in the CA1 subfield of gerbil hippocampus［J］. J Cereb Blood Flow Metab，2001，21(4):351-360.