AOM所致大鼠结肠癌形成过程中脑垂体远侧部TSH阳性细胞免疫组织化学观察

　　　　 作者：孙红亚， 唐军民， 唐岩， 甄昱， 盛树青

【摘要】 目的： 观察氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）所致大鼠结肠癌形成过程中，大鼠脑垂体远侧部促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）细胞的免疫组织化学变化并初探其意义。方法： 用断乳SD（Sprague Dawley）雄性大鼠30只，分为AOM实验组和对照组。实验组用AOM（15 mg/kg）每周腹腔注射，连续2周，诱导大鼠结肠癌的形成。分别于实验第10，30，34周取材，用免疫组织化学、图像分析法观察大鼠实验性结肠癌形成过程中，脑垂体远侧部TSH阳性细胞的变化。结果： 亚甲基蓝染色光镜下观察，可见AOM腹腔注射的大鼠结肠黏膜出现异常隐窝（aberrant crypt，AC ）和异常隐窝灶（aberrant crypt foci，ACF）。免疫组织化学显示，与同期正常对照组相比，实验组大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞阳性反应显著性减弱（P&<0.05）。结论： 在大鼠实验性结肠癌形成过程中，脑垂体远侧部TSH细胞变化可能与机体肿瘤的发生有关。

【关键词】 结肠癌； 垂体； 促甲状腺激素； 阳性细胞； 大鼠； 氧化偶氮甲烷

　　［Abstract］ Objective: To observe the TSH positive cells in the pars distalis of pituitary of rat with colon mucosa cancer induced by azoxymethane(AOM) by immunohistochemical staining.Methods： Thirty threeweek old Sprague Dawley（SD）male rats were randomly pided into two groups: Normal control group and experimental group.To induce rat colon mucosa cancer， 3week old SD male rats(experimental group) received intraperitoneal injections of AOM at a dose of 15 mg/kg once a week for two weeks.The rat pituitary tissues were excised from the 10week， the 30week and the 34week old rats.To observe the morphological changes of the TSH positive cells in the pars distalis of pituitary using immunohistochemical methods， the results were analyzed by image analysis system. Results： Stained by methylene blue， ACF and AC were showed in colon mucosa of rats received two weekly intraperitoneal injections of AOM.With immunohistochemical methods， the TSH positive cells in the experimental group displayed significant decrease compared with the homeochronous normal control group (P&<0.01). Conclusion： The results suggested that the TSH positive cells in the pars distalis of pituitary of rat with colon mucosa cancer induced by AOM might be related with the tumorigenesis.

　　［Key words］ colon mucosa cancer; pituitary; thyroid stimulating hormone; positive cells; rats; azoxymethane

　　机体是一个统一整体，通过神经内分泌免疫系统调节网络使得各组织、器官和系统的生理活动相互协调、相互制约，维持着机体的稳态，这是机体自然抗病的基础。肿瘤的发生、发展与机体的内分泌调节密切相关［1，2］，而垂体是机体调节网络的重要组成部分，目前有关垂体-甲状腺轴与消化道肿瘤关系方面的研究甚少。因此，本实验以实验性大鼠结肠癌为动物模型，观察脑垂体远侧部促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）阳性细胞的免疫组织化学变化，为探明内分泌腺与机体肿瘤发生发展的关系提供一些实验依据。

1 材料和方法

　　1.1 试 剂

　　氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM。美国田纳西大学Williams教授馈赠，美国Sigma公司产品）：生理盐水配制，终浓度为1.25 g/L。兔抗人TSH多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

　　1.2 动物及分组

　　3周龄断乳SD雄性大鼠30只，体质量45～50 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供。随机将大鼠分为实验组和正常对照组，每组15只。

　　1.3 模型建立及取材

　　实验组于第5，6周腹腔注射AOM，15 mg /kg；正常对照组不给AOM而注射同等液体量的0.9%无菌性生理盐水。分别于实验第10，30，34周3期取材，每期各组取5只大鼠。10%水合氯醛（2 ml/kg体质量）腹腔注射后取材，取结肠和脑垂体。垂体用Bouin液固定，浸蜡包埋，5 μm的石蜡切片备用。大鼠整段结肠用10%中性甲醛溶液固定后，用0.2%亚甲基蓝分段对大鼠结肠黏膜进行染色，解剖显微镜下计数异常隐窝灶（aberrant crypt foci，ACF）及异常隐窝（aberrant crypt，AC），以确定大鼠结肠癌建模成功。结肠和垂体石蜡切片常规HE染色，垂体曼氏（Mann′s）染色，均中性树胶封片。

　　1.4 免疫组织化学染色

　　免疫组织化学SP（Streptavidinperoxidase）法染色：垂体切片脱蜡至水；3％蒸馏水h3O2液封闭内源性过氧化物酶活性；加TSH抗体工作液（浓度为1∶100），过夜后加生物素标记的第二抗体工作液；加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素复合物工作液；常规DAB液显色；苏木精复染；中性树胶封片。对照组用PBS代替一抗，与其他组切片同步进行免疫组织化学显色。

　　1.5 图像分析及统计

　　将免疫组织化学结果，用Version 3.0图像分析系统进行分析。每一标本随机取5张组织切片，每张切片随机选取5个视野，测定TSH阳性细胞数量、标记面积以及平均灰度值，计算TSH阳性细胞面数密度（numerical density on area， NA， 即在二维图像上颗粒显示为大小不等的颗粒截面，参照系单位截面积内的颗粒截面数）、TSH阳性细胞的面密度（cell area in the measure field， Area， 每个被测视野的阳性细胞的总标记面积与每个被测视野的总标记面积的比值），并将TSH阳性细胞的平均灰度值换算成平均光密度（mean optic density， MOD）值，MOD值=lg（空白灰度值/被测视野灰度值）。采用SPSS软件进行组间均数t检验。

2 结 果

　　2.1 大鼠结肠组织结构

　　34周取材的大鼠结肠，正常对照组无AC，实验组均有AC以及ACF。光镜下观察，亚甲基蓝染色大鼠结肠AC较正常隐窝深染，呈深蓝色，体积增大，上皮细胞增高、上皮增厚。ACF明显突出黏膜表面，隐窝上皮细胞增高，上皮增厚；腺腔不规则呈乳头样向管腔内生长（图1）。HE染色，低倍光镜下观察AOM所致大鼠结肠癌模型的结肠隐窝间结缔组织内杂乱地布满各种形态的细胞，毛细血管非常丰富。高倍光镜下，隐窝上皮细胞排列较乱，极性消失，多不规则排列成多层，细胞大小不一，形态多样，细胞核大而深染，核质比例增大，细胞核分裂增多，可见腺管共壁背靠背和筛样结构，呈重度非典型性增生。腺腔内多见脱落坏死的瘤细胞、浸润的炎性细胞及分泌的嗜酸性团状物质（图2）。

　　2.2 大鼠垂体远侧部组织结构

　　正常对照组大鼠垂体标本的水平切面近似梯形，前窄后宽。HE染色，垂体远侧部由多种形态的团束状细胞组成，其中嗜碱性细胞的嗜碱性颗粒不易被苏木精所染（图3）；曼氏染色显示，嗜碱性细胞弥散分布于垂体远侧部，大小不一，形状不规则，细胞质内充满蓝色颗粒，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞的中央或一侧，偶见细胞的细胞质内有空泡。细胞之间充满血窦（图4）。实验组各期大鼠垂体远侧部组织结构与正常对照组相比较，无明显改变。

　　2.3 免疫组织化学

　　免疫组织化学SP法显示，大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞的细胞质呈棕黄色。高倍光镜下观察，TSH阳性物质呈颗粒状。用PBS代替一抗的免疫组织化学显色对照未见免疫反应阳性细胞。两组各期大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞形状相似，为多角形、圆形或椭圆形，少数细胞伸出胞质突起；细胞核圆形或椭圆形，常偏于细胞的一侧，未见有丝分裂相；TSH阳性细胞散在分布于整个垂体远侧部，远侧部头侧较少，常沿血窦排列，胞体与窦壁相贴（图5，6）。

　　2.4 图像分析及统计学处理

　　免疫组织化学显示，与同期正常对照组相比，实验组大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞阳性反应显著性减弱（P&<0.05），见表1。表1 大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞的图像分析n=15， ±s

　　3 讨 论

　　AOM是一种结肠癌致癌剂，它通过细胞膜和DNA的过氧化，引起结肠黏膜细胞的过度增殖［3-5］。在结肠癌发生、发展的研究中，通常采用给动物AOM，诱导啮齿类动物产生结肠癌，通过亚甲基蓝染色光镜下观察，若动物结肠黏膜出现ACF及AC，即说明大鼠结肠癌模型建立成功［6］。

　　肿瘤的发生、发展与机体的内分泌调节密切相关，近年很多研究表明［7，8］，胃肠激素与结肠癌形成有关。但胃肠激素在结肠癌形成过程中的作用及机制至今尚不完全清楚［9］，一般认为胃肠激素通过与细胞表面特异受体结合，通过细胞内一系列信号传导而发挥作用。作为机体内分泌系统重要组成部分的垂体-甲状腺轴，在胃肠道发育、分化中起着重要作用，目前有关垂体-甲状腺轴与消化道肿瘤关系方面的研究较少。但有一些研究证实［10，11］，恶性肿瘤患者中可有垂体-甲状腺轴的紊乱，表现为血中甲状腺激素、TSH浓度的下降，其发生机理并不十分清楚，可能与机体的保护机制有关。

　　本实验运用免疫组织化学的方法对分期取材大鼠的垂体远侧部TSH阳性细胞进行了观察，发现实验组与同期正常对照组相比，其垂体远侧部TSH阳性细胞的面密度和MOD值明显减少，说明TSH细胞内的TSH的含量减少；而面数密度的明显减少，表明TSH细胞的数量也有减少。由此，提示在实验性大鼠结肠癌形成过程中，垂体远侧部TSH的合成及贮存激素的功能降低。正常对照组的垂体TSH细胞数量及细胞内的TSH的含量随试验延长而减少，可能与年龄增大而相关细胞衰老的原因相似［12］。

　　由此，我们推测实验性大鼠结肠癌形成过程中，垂体远侧部TSH阳性细胞功能减弱，可能与机体自然抗病机制有关。垂体远侧部TSH细胞功能的抑制，有助于机体自身能量和氧消耗减少、基础代谢率降低，从而起到一种对自身的保护性作用。机体神经-内分泌-免疫网络的活化对宿主的内环境必将产生影响。当机体免疫系统激活后，往往产生一系列免疫源性细胞因子（如IL1，IL6，TNF，IFN等）介导的变化，其中 IL1，IL6可直接或通过垂体间接影响甲状腺功能，抑制T3，T4的分泌［1］，TNF生物活性与IL1相似，可抑制垂体远侧部TSH细胞的功能［13，14］。本实验化学致癌剂诱导大鼠结肠癌变后，垂体远侧部TSH细胞功能的抑制，可能与IL1，IL6，TNF，IFN等细胞因子有关。

　　

参考文献

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