大鼠创伤组织中CGRP，VEGF表达的变化及意义

　　　　　　作者：周建清， 王永忠， 蒋红艳

【摘要】 目的： 探讨创伤组织中降钙素基因相关肽（CGRP），血管内皮生长因子（VEGF）表达与损伤时间的相关关系。方法： 应用免疫组织化学方法、图像分析技术动态检测大鼠创伤组织中CGRP，VEGF的表达。结果： 生前创伤组（1，2，4，8，12，24 h）大鼠皮肤组织内 CGRP在神经纤维中表达明显高于正常对照组 （P＜0.05），死亡组大鼠皮肤组织中CGRP表达与正常对照组比较无明显变化（P&>0.05）。生前损伤组中CGRP表达在损伤后1 h明显增多，4 h达到高峰，8 h开始下降，以后逐渐恢复到正常。VEGF 在损伤后8 h皮肤组织中开始表达，72 h表达最强 (P＜0.01)，96 h开始下降。结论： 损伤组织中CGRP表达明显早于VEGF，而且具有时间的规律性，可作为早期创口损伤时间推断中的重要指标。

【关键词】 大鼠； 降钙素基因相关肽； 血管内皮生长因子； 免疫组织化学方法

　　［Abstract］ Objective: To investigate the relationship of the time of injury and the expressions of calcitonin generelated peptide(CGRP) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rat′s skin after injury. Methods： The expressions of CGRP and VEGF in the wound tissue were detected by immunohistochmisty technique and MIAS image analysis system. Results： The expression of CGRP in neurofibrils in the wound tissue(1，2，4，8，12，24 h) was higher than that in the control(P＜0.05). However，in postmortem injury group， there were no significant changes in antiCGRP immounreactivities in neurofibrils compared to the control group(P&>0.05). Further， the expression of CGRP could be detected increasingly in 1 h， and reached maximum in 4 h， returned in 8 h， then returned to normal there after. However， the expression of VEGF could be detected increasingly in 8 h after injury， and reached maximun in 72 h(P＜0.01)，then returned in 96 h. Conclusion： The expression of CGRP was erlier than VEGF in rat′s skin after injury， and it was time dependent. It could used as a biomarker to determine the time of injury in the early wound.

　　［Key words］ rat; calcitonin generelated peptide; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry

　　损伤时间推断是法医实际工作中非常重要的内容，但又一直是困扰法医工作者的一大难题。中枢及周围神经损伤后可引起中枢及外周部位降钙素基因相关肽 (calcitonin generelated peptide，CGRP)的表达变化，而 CGRP 的表达程度与神经损伤及修复再生的情况有一定的相关性。血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是与血管再生有关的细胞生长因子。国内有学者证实在颌面部爆炸创伤中 VEGF有表达变化［1］，潘秀花等［2］研究发现大鼠皮肤损伤愈合过程VEGF表达时间在损伤后1～14 d，但我们前期研究发现大鼠皮肤损伤后24～48 h VEGF表达明显增加［3，4］，因此，VEGF在创伤组织中表达时间在不同的研究中存在很大差异。本文探讨大鼠创伤组织中CGRP，VEGF表达变化，进一步研究CGRP，VEGF在损伤时间推断中的作用。

1 材料与方法

　　1.1 大鼠切创损伤模型建立

　　健康雄性SD大鼠60只，体质量（250±20） g，随机分为11组，每组5只。分别为正常对照组，创伤组（0.5，1，2，4，8，12，24，72，96 h）和死亡组（即死后损伤组）。剃毛后，用无菌手术刀片在大鼠背部脊柱右侧1 cm做切创，长约 5 cm，深及筋膜。在相应时间段颈椎脱位法处死大鼠，迅速取下大小为 1.5 cm×1.5 cm伤区组织，置 4%低聚甲醛 0.1 mol/L PBS中，4℃固定。

　　1.2 试 剂

　　一抗CGRP，VEGF抗体均购自美国Sigma公司；二抗及SABC试剂盒均购自武汉博士德生物技术公司。

　　1.3 对照组的设立　　　　

　　在本实验中分别设立正常组织对照，远离创区的组织对照 （创周5 mm以外），不加抗体对照及阳性对照。

　　1.4 免疫组化

　　采用链霉素亲和素－生物素－过氧化酶复合物法（SABC）。切片首先用80%甲醇(内含0.3%Ｈ2Ｏ2)于室温处理20 min以去除内源性过氧化氢酶， 而后用0.3%Triton X100于室温处理20 min以增加膜通过性， 然后将切片与抗体孵育， 所有抗体均用含有0.3% Triton X100和1%正常羊血清白蛋白的磷酸缓冲液稀释。切片首先与一抗兔抗大鼠CGRP抗体(效价为1∶800)在4℃冰箱放置2 d， 而后分别与二抗(效价1∶500)和ABC复合物在室温条件下孵育4 ｈ， 以上每一步间隙均用0.01 mol/Ｌ PBS充分洗涤(5 min×3次)。最后切片按试剂盒说明书进行染色。使用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗。

　　1.5 统计学处理

　　各组实验数据用±s表示，应用SPSS11.5软件进行单因素方差分析，两两比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 CGRP免疫组化观察

　　生前创伤组大鼠皮肤组织中，CGRP在神经纤维内可见多量棕黄色颗粒阳性表达，而且与正常对照组比较明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。死后损伤组皮肤组织中，CGRP在神经纤维内可见少量棕黄色颗粒弱阳性表达，且与正常对照组比较差异无统计学意义（P&>0.05）。生前创伤组中CGRP表达在损伤后1 h明显增多，4 h达到高峰， 8 h开始下降，以后逐渐恢复到正常（图1）。

　　2.2 VEGF免疫组化观察

　　正常对照组VEGF在上皮组织基底细胞内可见少量棕黄色颗粒的弱阳性表达，少数毛囊上皮细胞呈阳性表达，成纤维细胞呈阴性表达。生前创伤组伤后8 h上皮细胞内VEGF表达明显增加，12 h及24 h 则见创缘处上皮细胞内呈中等强度阳性表达，远离创缘的表皮及真皮，免疫组化染色无明显增强，毛囊上皮阳性反应细胞增多。伤后72 h肉芽组织的巨噬细胞及成纤维细胞胞质内呈强阳性表达，粒细胞呈阴性表达，表皮细胞亦呈强阳性表达，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。伤后96 h表皮细胞胞质内可见VEGF呈少量棕黄色颗粒的弱阳性表达。死后损伤组表皮及部分毛囊上皮呈弱阳性表达，其他细胞无表达。

　　生前创伤组中VEGF在损伤后8 h明显表达，12 h及24 h VEGF表达明显增加，72 h达到高峰， 96 h表达下降（P&<0.01），见图2。

　　3 讨 论

　　CGRP是一种神经肽， 在外周感觉神经系统中， CGRP是在胞体合成， 由轴浆运输转运至轴突末端。感觉神经受刺激后， 引起局部组织神经末梢中CGRP释放增加， 与此同时， 可能刺激CGRP合成也增加， 如合成速度大于释放， 局部组织中CGRP含量将升高， 反之则减少。本研究结果显示大鼠皮肤创面组织中CGRP蛋白表达明显高于正常对照组，提示皮肤创伤组织内神经纤维合成和分泌CGRP是明显增加的，与王波涛等［5］研究大鼠皮肤烫伤后创面组织中神经纤维合成和分泌CGRP减少的结果不一致，我们认为这可能与致伤因子不同有关。

　　在创伤愈合过程中，血管再生是一个重要的环节，细胞生长因子对这一过程的发生和发展具有重要的调节作用。VEGF 是一类作用于血管内皮细胞的糖蛋白，是主要的血管生成因子之一，具有强烈的促进内皮细胞增殖，诱导血管生成的作用。本研究结果显示损伤早期VEGF主要在上皮细胞内呈强阳性表达，损伤后期VEGF主要在巨噬细胞及成纤维细胞内呈阳性表达，明显高于正常对照组。与Corral等［6］研究皮肤损伤组织中VEGF表达明显增多相一致。

　　本研究进一步发现在大鼠创伤组织中CGRP及VEGF表达都呈规律性变化。生前创伤组中CGRP表达在损伤后1 h明显增多，4 h达到高峰， 4 h以后逐渐恢复到正常。多年来，纤维连接蛋白（fiberonectin， FN）是法医学中被视为一个推断损伤时间的较为可靠的指标，但是敏感度较低，而且FN随时间的变化趋势处于一个相当长的范围内，在4天左右才达到高峰，不利于作为早期损伤时间推断的指标［7］。而CGRP在损伤后1 h表达明显增多，4 h达到高峰，因此CGRP敏感度高，可作为早期损伤时间推断的参考指标。生前创伤组中VEGF在损伤后8 h明显表达，12 h及24 h VEGF表达明显增加，72 h达到高峰， 96 h表达减少，结果提示VEGF主要在损伤后期表达，不利于早期损伤时间的推断。综上所述，本研究结果提示CGRP在早期损伤时间推断中有重要的参考价值，而VEGF在损伤后期时间推断中有重要的参考价值。

参考文献

［1］ 张从纪，李慧增，周树夏，等.颌面部爆炸伤早期愈合过程中血管内皮生长因子的表达［J］.实用口腔医学杂志，2001，17（3）：217-219.

［2］ 潘秀花，杨占山，杨 晶，等.在创伤愈合中VEGF和Ang1表达的生物动力学变化研究［J］.苏州大学学报:医学版，2006，26(2)：178-181.

［3］ 周建清，王永忠，胡治国，等.大鼠创伤皮肤内血管内皮生长因子表达的免疫组化研究［J］.江苏大学学报:医学版，2003， 13(5)：421-424.

［4］ 周建清，王永忠，胡治国，等.大鼠损伤组织中VEGF，bFGF表达变化的免疫组化研究［J］.江苏大学学报:医学版，2004，14（1）：13-16.

［5］ 王波涛，陈 璧，胡大海，等.大鼠皮肤降钙素基因相关肽正常分布及烫伤后改变规律［J］.中华整形烧伤外科杂志， 1999， 15（1）: 62-65.

［6］ Corral CJ， Siddiqui A， Wu L， et al. Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during ischemic wound healing ［J］. Arch Surg， 1999，134(2):200-205.

［7］ 贺 盟， 余 松， 薛爱民， 等.人皮肤成纤维细胞早期损伤后EDAFN表达与损伤时间的关系［J］.法医学杂志，2007， 23（2）: 94-96.