【摘要】 为优选蚕豆皮中原花青素的微波辅助提取工艺，采用L9(34)正交设计并结合单因素轮换法，对蚕豆皮中原花青素的提取条件进行优化。结果，蚕豆皮中原花青素最佳提取条件为：提取剂浓度50%、微波功率400W、提取时间10min、料液比为1∶15，3次提取基本可将其完全提出，测得原花青素含量为2.32%。认为优选出的工艺稳定、合理、可行。
【关键词】 蚕豆皮;微波提取;原花青素
蚕豆皮(V icia faba Linn.)为豆科植物蚕豆的种皮，具有利尿渗湿的功效。据文献报道，蚕豆皮中含有原花青素[1]。原花青素(Proanthocyanidins)，是自然界中广泛存在的聚多酚类混合物，具有多种生物活性，是近年来不断开发研究的一种极强体内活性功能因子。国内生产的原花青素主要是从葡萄皮中提取，它也存在于松树皮、蚕豆皮和桑叶等中，含量在 2%～10%，其分子量在 500～20000Da 之间[2]。
微波提取是指在天然植物有效成分的提取过程中进入微波场，利用微波场的特性和优点来强化有效成分浸出的新型提取方法[3]。与传统溶剂提取法相比，微波提取技术具有作用时间短、速度快、提取效率高、节能等显著特点。本文运用正交试验研究蚕豆皮中原花青素微波提取工艺的影响因素，确定最佳提取方案，为提高蚕豆皮的附加值，进一步研究开发提供依据，也为原花青素的进一步研究和应用提供原料。
1 仪器和试药、试剂
1.1 仪器 TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司生产);微波提取设备(由格兰仕微波炉改选而成);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司生产);FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司生产);SHZ-D循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂生产);RE—52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂生产);
1.2 试药、试剂 蚕豆皮(粉碎至粒度为40目，放入广口瓶备用);儿茶素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110878-200102)。甲醇、乙醇、丙酮、硫酸、香草醛，均为分析纯。
2 实验方法
2.1 蚕豆皮中原花青素的提取方法
准确称取粉碎后的蚕豆皮5.0 g于150 mL圆底烧瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、微波功率条件下提取一定时间，取出过滤，将滤液减压浓缩，测定原花青素的含量。本文中以百分含量表示，即每100 g蚕豆皮经提取得到的原花青素的量。
2.2 原花青素含量的测定
原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体、直至十聚体等等。国际通用的原花青素的分析方法是分光光度法，本文选用香草醛检测法。
原花青素的显色机理与儿茶素相似，在酸性条件下，原花青素组成单元儿茶素的A环化学活性较高，其上的羟基可以和香草醛发生缩合反应，在浓酸作用下形成的产物变为有色的正离子，由于香草醛和多酚类物质的一对一的特异结合，根据此正碳离子吸光度可测定出原花青素含量。此法具有操作简单、重现性好、线性范围宽的优点，目前普遍用于测定原花青素的含量[4]。
2.2.1 标准曲线的绘制
1)溶液配制
儿茶素标准液：准确称取儿茶素标准品(65℃真空干燥至恒重)，用50%甲醇制成浓度分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的溶液作为标准溶液;30 g/L香草醛溶液：30 g香草醛溶于1000 mL甲醇中;30%硫酸溶液：30 mL硫酸(95%～98%)+70 mL甲醇混合均匀。
2)标准曲线
分别准确移取不同浓度的儿茶素标准溶液各0.5 mL于10 mL具塞比色管中，加入2.5 mL 30 g/L香草醛溶液，然后加入2.0 mL 30%硫酸溶液，30℃条件下避光反应20 min，以试剂溶液为空白，在500 nm处测定吸光度值，取标准液的浓度和吸光度数据经回归处理，回归方程y=45.22x+0.001，r=0.9995。结果表明，儿茶素浓度在0.004～0.02mg/mL范围内具良好的线性关系。
2.2.2 原花青素含量测定[5]
将浓缩液加50%甲醇定容至25mL量瓶中，取上述溶液1 mL，用50%甲醇定容至25 mL作为样品溶液;准确量取0.5 mL样品溶液，按照上述标准曲线方法进行测定，加入2.5 mL 30 g/L香草醛溶液，然后加入2.5 mL 30%硫酸溶液，30℃条件下避光反应20 min，以样品溶液为空白，即0.5 mL样品溶液+2.5 mL甲醇+2.0mL 30%硫酸溶液，在500 nm处测定吸光度值。
2.2.3 方法学考察
1)精密度实验 精密吸取样品溶液0.5 mL，于25 mL量瓶中，重复测定5次，得RSD为0.92%。2)稳定性试验 精密吸取同一样品溶液0.5 mL于25 mL量瓶中，照“2.2.2”项下操作，分别于显色后1、2、3、4、5h在500 nm处测定吸光度，结果RSD为1.27%，表明供试品溶液中原花青素在测定的5 h内可保持稳定。
2.2.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品5份，分别加入一定量的儿茶素标准溶液适量，按样品原花青素的提取方法提取后，照“2.2.2”项下操作，在500 nm处测定吸光度并计算回收率，结果平均回收率为96.86%，RSD为1.82%。
2.2.5 工艺优化方法 采用单因素试验法，对提取溶剂、提取溶剂浓度、浸泡时间、料液比、微波功率等进行初步考察，根据单因素试验结果确定正交试验的因素水平，优选蚕豆皮中原花青素的最佳微波提取工艺。
3 结果与分析
3.1 单因素试验
3.1.1 提取溶剂的影响
在相同的微波提取条件下，选用相同浓度的乙醇、甲醇、丙酮和蒸馏水进行提取，确定最佳提取溶剂，结果见图1。
由图1显示，采用蒸馏水提取的效果较差，乙醇的提取效果优于甲醇、丙酮。甲醇、丙酮均有一定毒性，不适宜应用于食品工业生产。因此，本实验选择乙醇作为最佳的提取溶剂。
3.1.2 溶剂浓度的影响
准确称取蚕豆皮5.0 g 5份，分别用30%、40%、50%、60%、70%乙醇50mL浸泡1h，微波功率400W辐射10min，考察溶剂浓度对提取结果的影响。
图1 提取溶剂对提取效果的影响
图2 提取剂浓度对提取效果的影响
由图2可见，乙醇浓度达到 50%时，原花青素的提取量最高，再升高乙醇浓度原花青素提取量已略有下降的趋势，原因是随着乙醇浓度的增大，使一些脂溶性物质的溶出增加。因此确定乙醇浓度 50%时为提取效果最佳点。
3.1.3 浸泡时间的影响
精密称取蚕豆皮5.0 g 5份于150 mL圆底烧瓶中，各加入50%的乙醇溶液50 mL，分别浸泡0.5、1、2、3、4h后微波功率400W辐射10min，考察浸泡时间对提取结果的影响。
图3 浸泡时间对提取效果的影响 由图3可知，在2 h以前，原花青素提取率随着浸泡时间的增长而增大，2 h后随时间的增长而略有减少。由于原花青素单元中含有多个羟基，在长时间浸泡过程中可能会引起其结构的变化，如氧化等。所以考虑到实验结果和实际成本，本文选择浸泡时间2 h。
3.1.4 料液比的影响
准确称取蚕豆皮5.0g 5份，分别加入50%乙醇25、50、75、100、125mL浸泡2h，微波功率400W辐射10min，考察料液比对提取结果的影响。
图4 料液比对提取效果的影响 由图4可知，当料液比达到1∶10后，再增大料液比，提取率趋于稳定，即一定比例的溶剂已将有效成份基本溶出完全，且过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并给后面的浓缩带来困难。所以用50%乙醇溶液浸泡时的最佳料液比为1∶10。
3.1.5 微波功率的影响
准确称取蚕豆皮5.0g 5份，加入50mL 50%乙醇室温的条件下浸泡2h，于100、200、400、600和800W功率下加热10min;考察微波功率对提取结果的影响。
图5 微波功率对提取效果的影响 由图5可知，随着微波功率的增加，原花青素提取量呈上升再下降趋势，当功率为400W时，原花青素提取率最高，曲线达到最高点。微波功率过高，一些活性成分会被破坏。
3.2 正交实验
3.2.1 正交试验设计 为优选出醇提的最佳工艺条件，在上述单因素试验所得数据的基础上，用L9(34)正交表，以原花青素得率为评价指标，对影响原花青素提取效果的因素：微波功率、乙醇浓度、提取时间等因素进行考察，因素水平见表1，试验安排见表2。表1 因素水平表
2.2.2项下方法制备样品溶液并测定原花青素含量，正交试验结果见表2，方差分析见表3。表2 正交试验方案及结果表3 正交试验方差分析表方差分析表明，因素的重要性依次为C&>B&>A，微波功率和料液比对原花青素的提取有显著影响，提取时间有一定影响。优选出的工艺为：A2B2C3，即提取时间10min，微波功率400W，料液比为1∶15。
3.3 提取次数的确定
分别取5.0g药粉，在上述已选取的最佳提取条件下，连续提取5次，结果如图6所示。
图6 提取次数对提取效果的影响
由图6可知，随着提取次数增加，原花青素的提取量累计增加。当提取次数大于 3时，曲线趋势已接近平缓，即原花青素提取量的增加已不明显。从节省溶剂和时间考虑，确定提取次数为3次。
3.4 验证试验
在选取的最佳提取条件下，对蚕豆皮中原花青素连续提取3次，测定，得原花青素含量为2.32%(RSD=1.2%，n=3)。
4 讨论
4.1 本实验研究了微波法提取蚕豆皮中原花青素的工艺条件，考察了微波输出功率、溶剂浓度、微波加热时间、料液比等重要工艺参数对原花青素收率的影响，微波法提取蚕豆皮中原花青素的最佳生产工艺条件为：使用50%乙醇，按料液比1∶15 将料液混合，在微波输出功率400W下，持续加热10 min，提取3次，100 g蚕豆皮经微波提取可得到 42.2 g粗提物，原花青素得率2.32%。由于粗提物中仍含有一些水溶性大分子的杂质如果胶和糖类，还有鞣质、有机酸等，它们会影响到蚕豆皮中原花青素的精制，故今后需要对其中原花青素的分离纯化做进一步的研究。
4.2 微波法是一种以溶液内的分子、离子接受微波辐射获得能量而迅速升温的加热方式，具有快速加热的优点，减少了有效成分在高温下的受热时间，对于热敏性物质的提取是十分有利的，且符合社会的节能环保要求。
4.3 本研究为产业化生产蚕豆原花青素提供了技术支撑，对蚕豆的深层次开发利用创造了十分有利的条件。
参考文献
[1] 李雪琴，裘爱泳.蚕豆生理活性物质研究进展[J]. 粮食与油脂，2002，(7)：34-35.
[2] 吕丽爽.天然抗氧化剂低聚原花青素的研究进展[J]. 食品科学，2002，23(2)：147-150.
[3] 杨锦宗.工业有机合成基础[M].北京：中国石化出版社，1998：50-51.
[4] 姚开，何强，吕远平，等.葡萄籽中原花青素含量不同测定方法比较[J].化学研究与应用，2002，14(2)：230-232.
[5] 孙芸，谷文英.硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J].食品与发酵工业，2003，29(9)：43-46.