作者：杨勇，吴世栋，张小钰，金群华
【摘要】 ：目的 通过建立大鼠膝关节前交叉韧带切断骨性关节炎（OA）动物模型，探讨该模型中软骨及软骨下骨病理变化。方法 取SD大鼠30只随机分成３组（术后2、6周和10周组）。每只大鼠右膝行前交叉韧带切断，造成膝关节不稳定动物模型，对侧为假手术侧。分别将每组动物于术后2、6和10周处死，取胫骨近段，比较各组骨关节大体形态及病理变化。光镜下观察指标有改良的Ｍankin评分、骨组织形态计量学参数。免疫组化法观察MMP-13在软骨细胞中的表达。结果 在造模后2、6周和10周软骨退变呈进行性发展。Ｍankin评分增高、MMP-13表达逐渐增强，与假手术侧相比有统计学意义（P＜0.01）。软骨下骨形态计量学分析显示，造模后早期软骨下骨骨量轻度减低（P＜0.05），之后骨量逐渐增加（P＜0.01）。结论 大鼠的前交叉韧带切断能够造成动物膝关节OA样改变，表现出软骨下骨吸收、骨重建的变化特点。
【关键词】 骨性关节炎；动物模型；软骨下骨；基质金属蛋白酶13
Abstract：Objective To establish an osteoarthritis model in rat knees by transacting anterior cruciate ligament，and characterizing subchondral bone remodeling， cartilage damage during the disease progression in the models of surgically induced OA. Methods 30 rats were pided into three group(2weeks、6weeks and 10weeks post-surgery group). Rats' right knee joints were subjected to anterior cruciate ligament transection (ACLT)，while the left knee served as control. Rats were sacrificed and the tibil plates were harvested which were studied in both gross-morphological and pathohistological ，at the same time Coimmunostaining for matrix metalloproteinase13 (MMP-13) was performed to investigate the progression of cartilage degradetion. Results The degeneration of articular cartilage of the surgery knees got worse by time. surgery knees Mankin's scores and MMP-13 expressions were significantly higher than those in the sham knees (P＜0.01). Histomorphometric analysis revealed subchondral bone loss within 2 weeks postsurgery(P＜0.05)followed by significant increases in subchondral bone volume relative to sham up to 10 weeks post-surgery(P＜0.01). Conclusion WACLT on rats can induce Osteoarthritic changes which involve cartilage and subcondral bone. This model have the merits of economical，convenient and short-terming.
Key words：osteoarthritis OA; animal model; subcondral bone; matrix metalloproteinase13
动物模型是研究骨性关节炎（osteoarthritis，ＯＡ）病理机制、治疗及预防的重要手段之一。目前OA的动物造模方法有多种，目的是最大程度地模仿人类OA的病理生理过程。本实验通过建立大鼠膝关节不稳定OA动物模型，并观察其软骨及软骨下骨的病变特征，以期进一步了解OA的病理过程及发病机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料
兔抗鼠基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase13，MMP-13）单克隆抗体购自美国Santa cruz公司，羊抗兔二抗EnVision购自上海基因科技有限公司。过碘酸雪夫氏（Periodic Acid Schiff）及阿辛兰 (Alcian Blue，AB-PAS)染色试剂盒购自福州迈新公司。ＳＤ大鼠由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.2 模型制做
取20周龄健康SD大鼠30只，雌雄不限，体重400～450g，无关节病变。将所有大鼠随机分为３组：术后２、6、10周组，每组10只。6.5%水合氯醛按100mg/kg大鼠腹腔注射麻醉， 备皮。模型侧：取右膝关节内侧长约0.8cm切口， 沿髌韧带内侧缘进入关节腔，找到前交叉韧带，用眼科剪剪断，生理盐水冲洗，依层缝合，术中不损伤软骨面。假手术侧：同时取对侧膝关节，入路同前，打开关节腔暴露前交叉韧带，冲洗，关闭切口。大鼠术后不做任何处理，分开饲养，自由活动及进食，每日强迫大鼠活动1h。
1.3 取材及标本处理
分别于术后2、6、10周将动物断颈处死，取膝关节上下各2cm区域的组织，去除皮肤，置于４%多聚甲醛液中，4℃下固定24h，固定后标本剔除周围软组织及韧带，PBS充分浸洗，流水冲洗2h，15%的EDTA液加微波脱钙2周， 流水冲洗24h，只留胫骨部分，将其沿冠状面分为3等份。修整组织块后石蜡包埋，作冠状面不连续切片，每个标本切9张，间隔100μm。各取3张分别行HE、AB-PAS、MMP-13免疫组化染色。
1.4 大体观察
取材时对新鲜标本的外观在肉眼及解剖显微镜下进行大体观察。
1.5 组织学评分
所有组织切片经HE及AB-PAS染色后，采用盲法由两名病理医师对组织结构进行详细的观察。每张切片选择5 个不同的视野，主要观察大鼠术后不同时间膝关节软骨及软骨下骨的病理改变；并参照Mankin改良的关节软骨病理评分标准［1］进行积分统计，满分14分。
1.6 软骨下骨形态计量学指标
HE切片在Olympus显微镜下（４0×）用Olympus图像采集系统在软骨下松质骨内随机取5个视野，用image pro plus图像分析系统(Version6.0，Media Cybernetics， Silver Spring， MD)行骨组织形态计量分析。测量参数为骨体积(BV/TV)，即测量范围内骨小梁体积占全部骨组织体积的百分比，为骨小梁面积／（髓腔＋骨小梁面积）×100%，反映骨小梁分布密度。每样本各视野相加取平均值。
1.7 MMP-13免疫组化染色
切片常规脱蜡入水，过氧化氢封闭， 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）微波法修复抗原，加1∶200兔抗鼠MMP-13单克隆抗体(美国Santa cruz公司)，4℃孵育过夜， PBS洗，加EnVision二抗，室温孵育30 min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，二甲苯透明，封片。阴性对照用PBS代替一抗。结果判定：每张切片由2名病理科医师独立观察具有代表性的5个高倍视野。每个高倍视野计数100个细胞，取观察结果的平均值进行计算，计数阳性细胞的百分率，阳性指数=(阳性细胞数／所计数细胞总数)×100%。阳性指数0～10%为（-），10%～25%为（±），≥25%为（＋），≥50%为（++），≥75%为（+++）。
1.8 统计学方法
实验数据采用均数±标准差表示，用SPSS 11.5统计软件，计量资料行方差分析，等级资料采用非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察结果
假手术侧：膝关节软骨、滑膜外观基本正常，软骨呈蓝白色，色泽明亮，微透明，表面无充血，无裂纹及软化。模型侧：２周组中有４只膝关节胫骨内髁软骨失去原有光泽，透亮度减低，灰白，无溃疡， 无裂纹。6周组，滑膜增生明显，软骨失去原有的光泽，灰白暗淡，不透亮，表面粗糙，内侧胫骨平台更明显，个别有裂隙及小溃疡，未见明显骨赘。10周组，内侧胫骨平台关节面粗糙不平，内侧胫骨平台较外侧低，表面可见溃疡糜烂，关节周缘结缔组织增生，并可见骨样增生（图１，见封3）。
2.2 光镜下观察组织学变化
模型侧的关节软骨病损在术后随时间呈进行性发展，且内侧胫骨平台病变较外侧显著。各时间点Mankin评分见表1。2、6、10周时假手术侧与模型侧评分差异均有统计学意义（P＜0.05 或 0.01）。表1 不同时间点的模型侧与假手术侧的
软骨Mankin评分比较（略）
假手术侧大部分为正常关节软骨。ＨＥ染色见表层光滑、平整，软骨细胞分布均匀，序列整齐，层次清楚，无簇集软骨细胞，潮线完整；AB-PAS染色均匀，无失染。
模型侧术后2周: 细胞排列规律性尚在， 偶见少量细胞簇集现象。
模型侧术后6周：中度软骨损伤为主， 软骨表面粗糙、表层裂隙，部分出现少许钙化层裂隙；但软骨基质内无明显纤维化；所有标本均出现细胞数目的变化，细胞散在增生和巢状增生， 簇聚细胞出现频率增加；部分出现潮线不清晰和中断；AB-PAS染色不均匀。
模型侧术后10周：以重度软骨损伤为主， 软骨表层出现较大缺损区， 细胞排列紊乱，软骨细胞层次不清， 细胞数减少，潮线消失， 部分出现软骨全层缺损， 钙化层难以分辨， AB-PAS染色大部分层次失染，伴软骨下骨硬化（图２，见封3）。
2.3 骨形态计量学分析
大鼠胫骨内侧髁软骨下骨组织计量学分析数据见表2，各组大鼠软骨下骨体积分数差异有统计学意义(P＜0.01)；２、6、10周时模型侧与假手术侧相比差异均有统计学意义(P＜ 0.05或 0.01) ；模型侧6、10周时分别与2周时比较差异有统计学意义（P＜ 0.01）；模型侧10周与6周比较差异有统计学意义（P＜ 0.01），图2，见封3。表2 假手术侧与模型侧不同时段软骨下骨体积（略）
2.4 MMP-13在软骨细胞中的表达
（表3）表3 假手术侧与模型侧不同时段MMP-13在软骨细胞中的表达结果（略）
假手术侧：大部份样本未见软骨细胞表达，少量偶见单个细胞弱表达。
模型侧：2周时在软骨中有极少量软骨细胞弱表达，与假手术侧相比阳性指数差异无统计学意义(P＞0.05)；６周时表达量增高，分别与２周时和假手术侧相比阳性指数差异有统计学意义（P＜0.01）；10周时表达量最高，分别与假手术侧及２、６周模型侧相比阳性指数差异有统计学意义(P＜0.01)，图５、见封3。
３ 讨论
目前ＯＡ动物模型诱导方式以关节内手术途径较为流行［2］。通过膝关节内侧半月板切除、前后交叉韧带切断等，使关节各结构的动态平衡失调，内在的生物力学性能改变，从而出现ＯＡ的病理表现。我们的研究采用大鼠膝关节前交叉韧带切断（ACLT）且动物体重较大（400～450g），这是因为体重与OA的发生发展相关［3］，大体重可以增加关节的负荷，尤其在关节不稳时使关节承受的异常负荷增加，从而提高造模的成功率。本实验发现术后早期（2周）关节软骨即开始出现少量簇聚的软骨细胞和单个肥大的软骨细胞；至中期时（6周）软骨中、深层细胞排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞，潮线断裂，深层肥大软骨细胞增多，软骨蛋白聚糖丢失；术后10周时，软骨表层出现较大缺损区， 细胞排列紊乱，软骨细胞层次不清， 潮线消失，部分出现软骨全层缺损，蛋白聚糖进一步丢失。Daubs BM 等［4］在狗的膝关节ＯＡ模型中也观察到类似的病理变化过程。
在ＯＡ的病理过程中，关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶（MMPs），打破了MMPs-TIMP (组织金属蛋白酶抑制剂)的平衡，造成对关节软骨细胞外基质的过度降解，是软骨逐渐出现溃疡、缺失等一系列退变表现的重要原因［5］。其中MMP-13可以在胶原纤维的三螺旋区裂解胶原纤维，对Ⅱ型胶原的活性最强。关节软骨基质中的胶原90%～95%是Ⅱ型胶原，所以观测MMP-13在ＯＡ软骨破坏过程中的表达尤为重要［6］。在此模型中观察到MMP-13在术后２周时表达不明显，到６、１０周时表达明显增强，且软骨下骨破骨细胞中也见表达。说明MMP-13与ＯＡ的病情发展密切相关，可以反映出ＯＡ软骨的退变程度。
软骨下骨的结构、生物力学性能及生物学方面的变化与ＯＡ密切相关［7］。软骨下骨转换的增加及之后软骨下骨的硬化被认为与OA的进展相关。因此评价软骨下骨改变骨体积有利于全面了解ＯＡ的病理变化过程。Botter SM 等［8］在大鼠骨关节动物模型中用micro-CT三维成像技术纵向观察造模处骨组织的变化４周，发现在模型早期软骨下骨小梁变薄，小梁间的连接变少，体积亦减小。在Hayami T等［9］的研究中也发现ＯＡ早期软骨下骨量减少，骨转换速率加快，骨吸收大于骨形成。随着病程的发展，骨重建骨量增加，软骨下骨硬化，骨赘形成。我们在此ＯＡ模型中发现，２周时在软骨尚未出现明显组织学变化之前，软骨下骨小梁体积减小，骨小梁变薄，呈现出轻度的骨吸收。表明在ＯＡ早期，软骨下骨转换活跃，骨吸收大于骨形成。６周时，软骨下骨量明显增加，１０周骨量进一步增加，即有继发性的骨增生骨质硬化。软骨下骨改变与ＯＡ的发生发展密切相关，在ＯＡ的发生发展中起重要作用，抑制软骨下骨的异常骨转换可能减缓ＯＡ进展［10］。
总之，该模型能模拟出ＯＡ随时间进展的基本病理过程，复制出骨性关节炎软骨退变过程，以及软骨下骨吸收、骨重建的变化特点，且具有造模周期相对短、经济、操作简便等优点，为下一步以软骨下骨为目标进行干预实验打下了基础。
参考文献
［1］Mankin HJ， Dorfman H， Lippiello L，et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data［J］. J Bone Joint Surg Am，1971，53(3):523-537.
［2］Roach H， Tilley S. The Pathogenesis of Osteoarthritis［A］.In: Bronner F， Mary C (Eds).Bone and Osteoarthritis ［M］. London: British Library Cataloguing in Publication Data，2007:1-3.
［3］Ameye LG， Young MF. Animal models of osteoarthritis: lessons learned while seeking the“Holy Grail”［J］. Curr Opin Rheumatol，2006，18(5):537-547.
［4］Daubs BM， Markel MD， Manley PA. Histomorphometric analysis of articular cartilage， zone of calcified cartilage， and subchondral bone plate in femoral heads from clinically normal dogs and dogs with moderate or severe osteoarthritis［J］. Am J Vet Res，2006，67(10):1719-1724.
［5］Kevorkian L， Young DA， Darrah C， et al. Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in cartilage［J］. Arthritis Rheum，2004，50(1):131-141.
［6］Johnson AR， Pavlovsky AG， Ortwine DF， et al. Discovery and characterization of a novel inhibitor of matrix metalloprotease-13 that reduces cartilage damage in vivo without joint fibroplasia side effects［J］. J Biol Chem，2007，282(38):27781-27791.
［7］Karsdal MA，Leeming DJ，et al. Should subchondral bone turnover be targeted when treating osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2008，16(6):638-646
［8］Botter SM， van OG， Waarsing JH， et al. Quantification of subchondral bone changes in a murine osteoarthritis model using micro-CT［J］. Biorheology，2006，43(3-4):379-388.
［9］Hayami T， Pickarski M， Zhuo Y， et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis［J］. Bone， 2006，38(2):234-243.
［10］Hayami T， Pickarski M， Wesolowski GA， et al. The role of subchondral bone remodeling in osteoarthritis: reduction of cartilage degeneration and prevention of osteophyte formation by alendronate in the rat anterior cruciate ligament transection model［J］. Arthritis Rheum ，2004，50(4):1193-1206.