作者：马江波，何仲义，李军平，焦旭文，韩怀钦
【摘要】 ：目的 探讨CUMS模型大鼠尾壳核(CPu)内NK1受体阳性神经元的形态学改变与抑郁症发病机制之间的关系。方法 对SD大鼠进行21d的应激刺激，制成6只CUMS抑郁模型，采用旷场试验与强迫游泳不动时间评定其行为学改变，同时观测体重变化以及应激前后24h糖水摄取量的变化。灌注取材后采用免疫组化ABC法观察CPu内NK1受体阳性神经元的数量和形态改变。结果 21d长期应激造成大鼠在行为学等指标上有抑郁症的表现：模型组穿行方格数(82.50±43.26)个，站立次数(1.16±1.47) 次，24h糖水消耗量（120.67±17.07）mL，强迫游泳不动时间(68.00±18.73)s，体重增长(81.5±11.4)g，模型组上述各指标值较对照组均有显著减少（P＜0.05或0.01）。免疫组化显示模型组CPu内NK1受体阳性神经元数目较对照组显著增多（模型组20.50±5.37，对照组16.25±5.59，P＜0.05）。部分神经元变大，突起变粗。结论 CPu区的NK1受体可能参与抑郁症发病。
【关键词】 抑郁症；尾壳核；NK1受体；免疫组织化学
Abstract：Objective To explore the association of the morphologic change of NK1 receptor in CPu of rats and the mechanism of depression using CUMS model.Methods Six male rats were exposed to chronic unpredictable mild stress (CUMS) to induce depression for 3 weeks. Exposure to CUMS significantly reduced open-field exploration， rearing， sucrose consumption in 24 hours， immovability time of force swimming and less weight gain with age. Results The behavior represented depression after stress of 21days in the mode group and the indexes included in open-field exploration (82.50±43.26)， rearing(1.16±1.47)，sucrose consumption in 24 hours（120.67±17.07）mL，immovability time of force swimming(68.00±18.73)s and weight increasing (81.5±11.4)g， and all above the values of indexes were significantly lower in the mode group than them in the control group （P＜0.05 or P＜0.01）. Additionally， the numbers of NKI positive receptor in CPu in mode group (20.50±5.37) were significantly more than these in the control group(16.25±5.59)(P＜0.05). Some neuron body became bigger and their axon or dendron became wider. Conclusion NK1 receptor in CPu was probably related with the mechanism of depression.
Key words：caudate putamen; chronic unpredictable mild stress;neurokinin-1 receptor; immunohistochemistry
世界卫生组织预计到2020年，抑郁症将可能成为仅次于心脏病的人类第二疾患，但人们对抑郁症的发病原因和机理尚不十分清楚。P物质(substance P，SP)是含11个氨基酸的神经肽，通过与其特异性受体神经激肽1(NK1)受体相结合而发挥作用［1］。SP存在于包括尾壳核（CPu）在内的很多脑区，NK1受体与SP的分布在总体上是相对应的，且二者在应激反应中起关键作用［1－2］ 。研究证明NK1受体拮抗剂有抗抑郁的作用 ［3－4］，国内也有关于抑郁症患者治疗前后血浆和脑脊液中P物质浓度变化的报道［5］。本实验采用免疫组化方法对孤养(separation)的长期温和性不可预知性应激(chronic unpredictable mild stress， CUMS)模型大鼠［6］CPu区NK1受体阳性神经元的形态学改变进行观察，以期对抑郁症的发病机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性SD大鼠12只(由第四军医大学实验动物中心提供)，体重190～220g。
1.2 动物分组
将大鼠置于昼夜节律光照条件下，自由进食进水，室温在18～20℃，饲养1周以适应环境。然后将大鼠随机分为模型组6只和对照组6只，对照组合笼饲养，模型组每笼1只。
1.3 抑郁症动物模型的制备
模型组参照文献［7－8］共接受21d不同的刺激，包括：电击足底(电流强度1 mA，电压45V，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共30min)；冰水游泳(4℃，5min)；热水刺激(45℃，5min)；摇晃(每秒1次，15min)；夹尾(1min)；禁水(24h)；禁食(24h)；睡眠剥夺(48h)；强迫游泳(5min)。实验过程中每种刺激至少给予2次， 同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。对照组不接受任何刺激，自由摄食饮水。在实验过程当中，刺激在另一个房间内进行，该房间的光照、温度基本与饲养间一致，刺激完毕后送回饲养间。
1.4 抑郁症动物模型的评价
在21d应激刺激开始前和完成后两组大鼠均进行旷场试验(open field) ［9-10］、24h糖水(1%)消耗量、5min强迫游泳(forced swimming test)不动时间(immobile time)的测定，旷场试验和强迫游泳不动时间行为评定采用盲法，由3位观察者同时进行观察，取平均值。造模过程中两组大鼠均在5个时间点（应激刺激第1、6、11、16、21天）测定体重，以对比体重增长情况。根据大鼠脑立体定位图谱［11］，选取Bregma -2.30～-2.56mm区间大鼠脑切片，每只大鼠选1张，选取标准参照海马长度，以海马伞外侧缘约居同侧脑片中间部位为准，此切面CPu区200倍视野可以拍摄7张照片，每张切片选从背侧至腹侧第4、5共2个视野进行NK1受体阳性神经元计数，对于视野周边部骑跨界线的神经元，只对骑跨上界和左界的神经元进行计数。
1.5 标本制备
21d应激及上述测定完成后，将两组大鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg)腹膜腔注射麻醉后，插管至升主动脉，先以100mL 0.025mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS，pH7.2)冲洗血液，再用500mL含4%多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(phosphate buffer，PB，pH 7.2)灌注固定，持续30min以上。灌毕立即取脑，后移入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB中4℃过夜，至其沉底。冰冻切片机行脑冠状切片，片厚25μm，各分为2套收集。模型组和对照组第1套切片用于NK1受体的免疫组织化学染色，具体步骤如下：(1)兔抗NK1受体(1∶500 Sigma)室温下孵育过夜；(2)生物素结合的驴抗兔(1∶200 Chemico)室温下孵育4h；(3)ABC(1∶100，Vector)室温孵育切片4h。其中步骤(1)和(2)用含5%羊血清、0.05%叠氮钠、0.5%Triton X-100和0.25%角叉菜胶的0.05mol/L的PBS稀释，步骤(3)用PBS稀释。上述反应完成后的切片进行DAB和h3O2 呈色、裱片、晾干，然后进行脱水透明、DPX封片后光镜下观察并拍照。
第2套切片用于对照实验。用正常血清替代一抗血清进行免疫组织化学染色，结果为阴性。
1.6 统计学方法
结果采用SPSS 11.0软件进行分析，数据以均数加减标准差(x±s)表示，组间检验采用t检验。
2 结果
2.1 两组大鼠体重的变化
模型组和对照组大鼠在应激前体重差异无统计学意义；从应激第11天起，模型组大鼠体重明显低于对照组（P＜0.01）；至21d慢性应激后两组大鼠体重增加差别也有统计学意义(P＜0.01)，见图1、表1。
2.2 旷场试验、24h糖水消耗量和强迫游泳不动时间
应激前两组大鼠在旷场试验的穿越方格数和站立次数无统计学意义；应激后模型组较对照组大鼠穿越方格数和站立次数明显减少（P＜0.05或＜0.01）。
应激前两组大鼠24 h糖水消耗量无统计学意义；应激后模型组较对照组24 h糖水消耗量明显减少，结果有统计学意义(P＜0.01)。
应激前两组大鼠强迫游泳不动时间差异无统计学意义；应激后模型组5min游泳不动时间较对照组有明显延长 (P＜0.01)，见表1。表1 模型组应激后大鼠体重和行为学指标变化（略）
2.3 免疫组化染色结果
免疫组化染色可见两组CPu区均散在NK1受体阳性神经元，胞体呈棕色，圆形或椭圆形，大部分可见突起，也可见呈网络状分布的NK1受体阳性终末。CPu区NK1受体阳性神经元计数，模型组（20.50±5.37），对照组（16.25±5.59），模型组阳性细胞较对照组显著增多（P＜0.05）。模型组较对照组NK1受体阳性神经元的直径增大，突起变粗，NK1受体阳性末梢也明显变粗、染色加重，见图2、3（见封2）。
3 讨论
抑郁症的核心症状包括兴趣丧失、活动能力下降、快感缺乏，其它症状包括体重减轻、易于绝望等。在众多抑郁症动物模型中CUMS模型和习得性无助（learned helplessness，LH）模型被认为是最有价值和最确定的动物抑郁模型［12-14］， CUMS模型很好地模仿了人类抑郁症的发病原因、各种症状、病程以及治疗效果 ［12］。旷场试验（又叫敞箱试验）的水平运动反映动物的活动度，垂直运动反映动物对陌生环境的好奇程度；糖水消耗量作为测量快感缺乏的有效客观依据［13］；强迫游泳不但被广泛地用来复制应激模型，而且也常被用来评价模型 ［12，14］。本实验中模型组动物在应激21d后，水平运动和垂直运动得分、糖水消耗、强迫游泳不动时间较对照组显著减少，体重增长缓慢，符合国际上公认的抑郁情感障碍动物模型的特征。
SP是一种脑肠肽，广泛地存在于外周组织器官和神经系统内，具有多种生物活性，在痛觉传递、胃肠运动、血管扩张、呼吸运动、伤口愈合等过程中均发挥作用。在中枢神经系统内，SP阳性神经元广泛地分布于包括CPu在内的很多脑区［2］，相对于缓激肽(bradykinln)而言，SP被称为速激肽或者神经激肽，它是通过与其特异性受体NK1受体相结合而发挥作用，二者的分布在总体上是相对应的。近些年来SP及其特异性受体NK1受体与抑郁症的关系愈来愈受到人们的关注［15-16］。抑郁症是一种发病原因和发病机制极为复杂的疾病，单胺学说和受体学说对抑郁症发病机制的解释已被人们广泛接受，此二学说认为抑郁症是由于脑内单胺递质(如NE和5-HT)的含量过低所致，抗抑郁药可以引起突触间隙单胺递质浓度增高，从而达到抗抑郁的效果［17］，但这并不能解释抑郁患者血浆和脑脊液中升高的SP浓度会在有效治疗后降低的问题［4］，也不能解释NK1受体拮抗剂可以抗抑郁的问题［16］。有人认为NK1受体拮抗剂的抗抑郁作用是通过5-HT和去NE来发挥的［18-19］，但也有人认为NK1受体拮抗剂MK-0869对于5-HT、NE和DA转运或者对单胺氧化酶A和B，很少有或没有亲和力，MK-0869的抗抑郁作用是通过结合NK1受体来实现的［1］。总之，NK1受体在抑郁症发病过程中的作用尚存在争议。
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