作者：罗永云，李昭宇，师志云，棘怀庆，雄英，孙俊峰， 赵巍
【摘要】 ：目的 探讨细粒棘球蚴重组抗原（rEgP-29）接种小鼠后的免疫保护机制。方法 ICR小鼠随机分为免疫组和对照组，采用rEgP-29免疫、Eg原头蚴攻击感染小鼠后20周，以MTT法检测经刀豆蛋白（ConA）和rEgP-29刺激后T淋巴细胞增殖水平，ELISA法检测体外脾细胞诱生的IL-2、IL-4和IFN-γ水平。结果 MTT法检测证实rEgP-29免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平明显高于对照组（P＜0.05）；ELISA法检测表明，免疫组小鼠经ConA或rEgP-29诱生的IL-2、IFN-γ水平与对照组相比显著增加（P＜0.05），而IL-4水平无明显变化。结论 rEgP-29可能诱导Th1型免疫应答为主，对抗Eg原头蚴攻击感染。
【关键词】 细粒棘球蚴；重组抗原EgP-29；细胞因子
Abstract：Objective To investigate the immunologic mechanism in mice immunized with recombinant EgP-29 vaccine of Echinococcus granulosus against Eg protoscolices.Methods ICR mice were subcutaneously and intranasally vaccinated by the vaccine， followed by the chanllenge with Eg protoscolices on the 8th week of vaccination and the sarifie on the 20th week of infection to separate splenocytes， to dectect the proliferation activity of spleen T lymphocytes by MTT assay， and to measure the level of IL-2，IL-4 and IFN-γ by ELISA. Results As demonstrated by the MTT assay， the rEgP-29 antigen could stimulate specifically the proliferation of splenic T lymphocytes in mice. ELISA assay indicated that the level of IL-2 and IFN-γin immunity group were significantly increased after stimulus with ConA or rEgP-29 (P＜0.05). There was no significantly change in the level of IL-4. Conclusion The rEgP-29 vaccination induces Th1 cellular response in mice against Echinococcus granulosus protoscolices infection.
Key words:echinococcus granulosus; EgP-29 vaccine; cytokines
细粒棘球蚴病（Echinococcosis）又称囊型包虫病（Cystic echinococcosis，CE），是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）幼虫引起的一种人畜共患寄生虫病。Torcal等［1］发现CE患者血清白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)升高，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)降低；Touil等［2］证实CE患者的血清γ干扰素（IFN-γ）和TNF-α升高；Haralabidis等［3］的研究显示Eg感染小鼠IFN-γ和TNF-α在感染后1-129d升高，在感染后130-209d降低；Fraize M［4］验证了细粒棘球蚴幼虫期表达的2种抗原EgA31和EgTrp的免疫原性，可使小鼠脾细胞的CD4+/CD8+比率和IL-12、IFN-γ、IL-10以及IL-6细胞因子显著升高，同时能提高血清IgG和IgA的抗体滴度，这些资料表明IL-2、IL-4和IFN-γ等细胞因子在宿主对细粒棘球蚴的免疫应答中可能起重要作用。本文是在成功构建rEgP-29的基础上，将该抗原免疫小鼠，在原头蚴攻击后观察小鼠脾淋巴细胞增殖水平和脾细胞诱生上清液中IL-2、IL-4和IFN-γ等细胞因子的变化，以研究rEgP-29的免疫保护作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
ICR小鼠，6～8周（18～22g），雄性，清洁级，购自宁夏医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂
EgP-29重组蛋白为本室构建。RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品；ConA（刀豆蛋白A）、MTT（四甲基偶氮唑盐）购自北京华美生物公司；小鼠IL-2、IL-4和IFN-γELISA试剂盒购自上海西唐科技生物有限公司。弗氏完全和不完全佐剂购自Sigma公司。
1.3 动物分组
将20只小鼠随机分为两组，A组为免疫组，注射rEgP-29加弗氏佐剂10μg/100μL；B组为对照组，注射弗氏佐剂加PBS每只100μL，每2周免疫1次，共3次。采用背部皮下多点注射免疫，每次注射量为100μL/只。
1.4 攻击感染
免疫小鼠8周后，免疫组和对照组每只小鼠用1500个棘球蚴原头节腹腔内注射进行攻击。至实验结束时，两组各有2只小鼠死亡。
1.5 脾细胞悬液制备
攻击感染后第20周剖杀各组小鼠。小鼠眼眶取血，颈椎脱臼处死后置75%乙醇中消毒3min；无菌取脾，匀浆，用2mL PBS冲洗，200目尼龙膜过滤，滤液置10mL离心管，加5～10倍的红细胞裂解液溶解红细胞，离心5min（2000r/min）；去上清，用PBS洗2次，离心5min（2000转/min）；去上清，加2mL PBS，计数后用含10%BSA的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×106/mL；台盼蓝染色后计数脾细胞存活率＞95%。
1.6 攻击感染后小鼠脾淋巴细胞增殖水平测定（MTT法）
上述攻击感染后20周剖杀的各组小鼠的脾细胞悬液（5×106/mL）加至96孔细胞培养板，每份标本6个平行孔，每3个平行孔加100μL细胞悬液和100μL ConA，另3个平行孔各加100μL细胞悬液和100μL重组抗原，用RPMI 1640配液，每孔终浓度为5μg/mL。并设3个对照孔，加100μL细胞悬液和100μL RPMI 1640培养液。置37℃ 5% CO2条件下培养72h，培养结束前4h，加入20 mL MTT（5mg/mL），继续培养4h，结束后2000r/min，离心10min，弃100μL上清，加100μL二甲基亚砜（DMSO）振荡，轻轻反复吹打至甲簪（formazane）充分溶解，测定光密度（OD490nm）。
1.7 攻击感染后小鼠细胞因子的诱生及检测
上述攻击感染后20周各组小鼠的脾细胞悬液（5×106/mL）100μL/孔加至96孔细胞培养板，分为ConA刺激组、rEgP-29刺激组和无刺激物组，分别加入100μL ConA和rEgP-29诱生细胞因子，工作浓度皆为5μg/mL，每份标本均重复3孔，37℃，5% CO2培养72h， 2000转/min，离心10min，收集上清液100μL，-20℃冰箱冻存，用于检测脾细胞诱生的IL-2、IL-4和IFN-γ水平（均设2个复孔）。同时设PBS对照组。IL-2、IL-4和IFN-γ的含量测定按试剂盒说明书进行。
1.8 统计学方法
采用SPSS 11.0软件进行分析，组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 攻击感染后小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平
用ConA刺激免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组（P＜0.01），用EgP-29重组抗原刺激的免疫增殖水平较对照组显著增高（P＜0.05）。表1 rEgP-29免疫、原头蚴攻击后小鼠脾淋巴细胞增殖水平（略）
2.2 攻击感染后小鼠脾细胞分泌IL-2水平的变化
当用rEgP-29诱生时，免疫组小鼠脾细胞分泌的IL-2水平显著高于对照组（P＜0.05）；而用ConA或不加任何刺激物时，免疫组IL-2水平较对照组增高，但差异无统计学意义（表2）。 表2 rEgP-29免疫、原头蚴攻击后小鼠脾细胞分泌IL-2水平（略）
2.3 攻击感染后小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平的变化
当用ConA刺激时，免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平显著高于对照组（P＜0.05）；而用rEgP-29或不加任何刺激物时，免疫组IFN-γ水平亦高于对照组，但差异无统计学意义（表3）。表3 rEgP-29免疫、原头蚴攻击后小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平（略）
2.4 攻击感染后小鼠脾细胞分泌IL-4水平的变化
加ConA或rEgP-29或无刺激物时，免疫组小鼠的脾细胞分泌IL-4水平均较对照组有所增高，但差异均无统计学意义（表4）。表4 rEgP-29免疫、原头蚴攻击后小鼠脾细胞分泌IL-4水平（略）
3 讨论
在寄生虫感染中，CD4+和CD8+T细胞都参与宿主的免疫保护和免疫病理损伤。CD4+T细胞活化后，分化的效应细胞主要为辅助性T细胞（Th细胞），根据其分泌的细胞因子不同又可分为Th1细胞和Th3细胞。Th1细胞主要产生IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，介导保护性免疫，有利于宿主清除棘球蚴。Th3细胞可产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，促进体液免疫应答，有利于虫体在宿主体内的寄生，二者作用常相互拮抗。其中Th1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用，IL-2和IFN-γ能增强抗原递呈过程，内源性IFN-γ可促使T细胞分化为Th1细胞，产生更多的IFN-γ，起到一种正反馈调控作用。Th3分泌的IL-4水平降低，解除了对Th1细胞的抑制效应，使Th1分泌较多的IL-2、IFN-γ、TNF-α。各种免疫细胞和细胞因子之间相互促进和相互调节，形成免疫调节网络，加强宿主Th1反应，提高宿主抗细粒棘球蚴感染的保护力。
A/J小鼠对泡球蚴有相对较强的抵抗力与T细胞增生导致高水平的Th1细胞因子IL-2和IFN-γ有关［5］。Chabalgoity等［6］将细粒棘球绦虫重组St-FABP疫苗分别采用静脉注射和口服免疫接种BALB/c鼠，在免疫后6周杀鼠取脾，分离脾淋巴细胞；用FABP抗原测记培养发现脾细胞在培养后1d可产生少量IL-2，在培养后2～6d可产生高水平IFN-γ，但不产生IL-4。曹得萍［7］将Eg原头节腹腔接种昆明小鼠20d后给予异搏定和阿苯达唑治疗，在化疗后90d发现血清IL-2增加。Rigano等［8-10］证实CE患者外周血单核细胞（PBMCs）可产生高水平IL-4，阿苯达唑治疗后发现，完全有效者产生高水平IFN-γ和低水平的IL-4，无效者产生高水平IL-4，RT-PCR证实化疗成功者的IFN-γ和TNF-α mRNA表达显著增强，无效者相反。本研究分别检测rEgP-29抗原免疫、细粒棘球蚴攻击感染20周后小鼠Th1细胞因子IL-2、IFN-γ和Th3细胞因子IL-4，与对照组相比，ConA或rEgP-29诱生的免疫组IL-2、IFN-γ水平显著增加，IL-4水平无明显变化。结果表明rEgP-29抗原可能以诱导Th1型免疫应答为主，与以上结果一致。同时，两组小鼠分别用ConA或rEgP-29刺激后脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组，表明rEgP-29免疫小鼠脾淋巴细胞在体外能被rEgP-29抗原特异性刺激增生，并活化T细胞产生T细胞为主的免疫力。
本研究结果提示，不同重组蛋白由于内在结构及功能的不同，可诱导机体产生不同的免疫保护力，其抗包虫的免疫保护机制也较复杂。本实验中的rEgP-29抗原诱导小鼠产生免疫保护机制的动态分析尚需进一步研究。
参考文献
［1］Torcal J， Navarro ZM， Lozano R， et al. Immune response and in vivo production of cytokines in patients with liver hydatidosis［J］. Clin Exp Immunol，1996，106:317-322.
［2］Touil BC， Sanceau J， Tayebi B， et al. Relationship among airculating interferon， tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6 and serologic reaction against parasite antigen in human hydatidosis［J］. J Interferon Cytokines Res，1997，17:211-217.
［3］Haralabidis S， Karagouni E， Frydas S， et al. Immunoglobulin and cytokine profile in murine secondary hydatidosis［J］. Prarasite Immunol，1995，17: 625-650.
［4］Fraize M. Immunogenicity of two Echinococcus granulosus antigens EgA31 and EgTrp in mice［J］.Parasitol Res，2005，96(2):113-120.
［5］Emery I，Liance M，Leclerc C.Secondary Echinococcus multilocularis infection in A/J mice:delayed metacestode development is associated with Th1 cytokine production ［J］.Parasite Immunol，1997，19(11):493-503.
［6］Chabagoity JA， Garrison JA， Esteves A，et al. Expression and immunogenicity of an Echinococcus granulosus fatty acid-bingding protein in live attenuated Salmonella vaccine strains［J］. Infect Immun， 1997，65:2402-2412.
［7］曹得萍. 继发性棘球蚴病小鼠体内细胞因子改变的研究［J］. 热带医学杂志，2004，4：385-389.
［8］Rigano R， Profumo E， Felice GP，et al. In vitro production of cytokines by peripheral blood mononuclear cells from hydatid patients［J］. Clin Exp Immunol，1995，99:433-439.
［9］Rigano R， Profumo E， Ioppolo S， et al. Immunological markers indicating the effectiveness of pharmaclolgical treatment in human hydatid disease［J］. Clin Exp Immunol， 1995，102:281-285.
［10］Rigano R， Profumo E， Buttari B，et al. Cytokine gene expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from patients with pharmacological treated cysitci echinococcosis［J］.Clin Exp Immunol， 1999，118:95-101.