作者：周茹 纳春祥 徐清斌 王锐 郑萍
【摘要】 目的 研究氟伐他汀(fluvastatin)对脂多糖(LPS)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的离体大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)表达组织因子(TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)的影响。方法 体外培养RAEC，分别给予LPS和AngⅡⅡ刺激，采用ELISA法检测氟伐他汀对RAEC TF 和TFPI表达的影响。结果 氟伐他汀0.01、0.1、1和10 μmol/L组能剂量依赖性抑制LPS和AngⅡ引起的TF表达增强；氟伐他汀0.01、0.1、1和10 μmol/L组TFPI表达增强，呈剂量依赖性。结论 氟伐他汀能抑制引起血栓形成的TF表达，增加TFPI表达。
【关键词】 氟伐他汀 抗血栓 TF TFPI
氟伐他汀是第一个完全经化学合成的亲水性羟甲戊二酰辅酶(HMG-COA)还原酶抑制剂，除了具有很好的调脂作用外，还具有预防心血管疾病、抗炎抗氧化、免疫抑制等多种药理作用［1］。临床上用于治疗高胆固醇血症、急性冠脉综合征等疾病。近年来的研究发现体内活动性凝血过程和病理性血栓形成的关键是组织因子(TF)途径启动。TF即凝血因子Ⅲ，在启动外源性及内源性凝血过程中均起重要作用。多种生理或病理性刺激物，如脂多糖(LPS)［2］、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)［3］等，均可影响体外培养内皮细胞TF的表达，可以使内皮细胞TF表达升高。因此，病理情况下血管中TF的异常表达与释放可迅速启动血液凝固过程，与多种心血管疾病如动脉粥样硬化及某些血栓栓塞的发生有密切联系。组织因子途径抑制物(TFPI)是组织因子途径调节物，能抑制TF启动的外源性凝血。本研究旨在观察氟伐他汀是否通过减少大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)中TF和增加TFPI发挥抗血栓作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品 LPS、AngⅡ购自Sigma公司；胎牛血清购自兰州民海生物有限公司，批号20050901；SABC-AP Kit试剂盒购自美国R&&D公司；TF和TFPI ELISA试剂盒购自R&&B公司；氟伐他汀购自北京诺华制药有限公司，批号R4881。
1.1.2 动物 SD大鼠，雄性，体重200～250g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.1.3 仪器 302型二氧化碳孵育箱，美国SHELLAB公司生产；DG5031型酶标仪，华东电子集团医疗装备有限责任公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 RAEC的培养、纯化和鉴定 取大鼠胸主动脉至髂总动脉分支处，纵形剪开血管腔，将主动脉剪成1mm×1mm的小块，组织块内膜面朝下置于1.5%明胶溶液包被的培养瓶壁，加入含20%胎牛血清的完全培养液(含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、40 U/mL肝素、150 μg/mL ECGS)静置培养3d，3～5d换液1次。通过差速贴壁法和机械刮除法纯化内皮细胞。组织块贴壁30min后更换培养液，弃去未贴壁的其余细胞，纯化内皮细胞。倒置显微镜下，在培养瓶上划出不是内皮细胞生长的区域，用橡皮擦子在该区域内反复推刮、破坏细胞，吸弃培养液，更换新培养液。利用CD31抗原，通过SABC免疫组化法染色，AP显色鉴定RAEC.
1.2.2 氟伐他汀对LPS和AngⅡ诱导RAEC表达TF的影响 实验分组：①正常对照组；② LPS组(1mg/L)；③ LPS(1mg/L)＋DMSO(0.07％)组；④4种不同浓度的氟伐他汀治疗组：A组为 LPS(1mg/L)+氟伐他汀(0.01 μmol/L)组；B组为LPS(1 mg/L)+氟伐他汀(0.1 μmol/L)；C组为LPS(1 mg/L)+氟伐他汀(1 μmol/L)；D组为LPS(1mg/L)+氟伐他汀(10 μmol/L)。
1.2.3 氟伐他汀对诱导RAEC表达TF的影响 实验分组：①正常对照组；②AngⅡ(10-6 mol/L)组；③AngⅡ(10-6 mol/L)＋DMSO(0.07％)组；④4种不同浓度的氟伐他汀治疗组：A组为AngⅡ(10-6 mol/L)+氟伐他汀(0.01 μmol/L)；B组为AngⅡ(10-6 mol/L)+氟伐他汀(0.1 μmol/L)；C组为AngⅡ(10-6 mol/L)+氟伐他汀(1 μmol/L)；D组为AngⅡ(10-6 mol/L)+氟伐他汀(10 μmol/L)。
1.2.4 氟伐他汀对RAEC表达TFPI的影响 实验分组：①正常对照组；② DMSO(0.07％)组；③4种不同浓度的氟伐他汀组：A组为氟伐他汀(0.01 μmol/L)；B组为氟伐他汀(0.1 μmol/L)；C组为氟伐他汀(1 μmol/L)；D组为氟伐他汀(10 μmol/L)。
以上各大组取生长状态良好的第3代RAEC接种到预先铺有1.5％明胶的24孔培养板，每孔2±0.2×105细胞，待细胞生长融合，弃上清，用D-Hanks洗2遍，换成含1％胎牛血清的DMEM培养基，每孔0.5 mL。每组3个复孔，37℃培养箱内分别继续孵育12、24h和48h。ELISAl法检测各组RAEC条件培养液中TF、TFPI含量
1.3 统计学方法 实验结果以表示，采用SPSS 11.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 RAEC培养 倒置显微镜下，用组织块贴壁法进行的原代培养，20h后可见动脉植块周围即有细胞生长，并逐渐向外延伸，36h后可见细胞贴壁，呈扁平或短梭形或多角形。原代培养4d后，可见大部分贴壁细胞连接形成网状毛细血管样，细胞密度较低。5d后，可见许多内皮细胞岛出现。继续培养，细胞岛增大，可区分为细胞密度较大的中央区和密度较小的边缘区。中央区的细胞呈三角形，边缘区细胞呈梭形或三角形，与周围细胞岛边缘区相连。约9d后细胞融合成片。融合生长的内皮细胞呈单层镶嵌状排列，似“鹅卵石样”或“铺路石样”，出现接触抑制现象。传代培养的内皮细胞30min即可贴壁，5～7d融合成单层。培养的RAEC经CD31抗原免疫组化染色，细胞膜和细胞浆染成黑紫色(图1，见封4)。
2.2 氟伐他汀对LPS诱导RAEC表达TF的影响 未经LPS刺激的RAEC中，只能检测到微量的TF；与正常对照组相比，经1 mg/L LPS作用12h，各组TF浓度均升高。与模型组相比，氟伐他汀0.1、1、10 μmol/L组TF浓度降低(表1)。
表1 氟伐他汀对LPS诱导RAEC释放TF的影响（略）
与对照组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与LPS相比*P＜0.05，**P＜0.01
2.3 氟伐他汀对AngⅡ诱导RAEC表达TF的影响 未经AngⅡ刺激的RAEC中，只能检测到微量的TF；与正常对照组相比，经10-6 mol/L AngⅡ作用24h，各组TF浓度均升高。与模型组相比，氟伐他汀0.01、0.1、1、10 μmol/L组TF浓度降低(表2)。
表2 氟伐他汀对AngⅡ诱导RAEC释放TF的影响（略）
与对照组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与AngⅡ组相比*P＜0.05，**P＜0.01
2.4 氟伐他汀对RAEC表达TFPI的影响 与正常对照组相比，氟伐他汀0.01、0.1、1、10 μmol/L组TFPI浓度升高(表3)。
表3 氟伐他汀对RAEC释放TFPI的影响（略）
与对照组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
3 讨论
TF即凝血因子III，是一个由263个氨基酸组成的低分子量(47kD)跨膜单链糖蛋白，作为外源性凝血途径的启动因子，它与凝血VII因子(FVII)结合形成复合体，使FVII激活成为有活性的FVIIa，启动凝血瀑布反应，形成凝血酶和纤维蛋白，导致血栓形成。在动脉粥样硬化斑块中，无论细胞成份还是非细胞成份中都存在TF。粥样硬化斑块中坏死脂质核心和高浓度的TF是强大的促凝物质，提示TF是动脉粥样硬化斑块脂质核心内的最重要的活性因子之一，在血栓的形成、启动和发展中起着重要作用。斑块破裂后形成血栓，导致冠状动脉完全或不完全性阻塞，从而产生冠状动脉的急性事件。全身或者斑块局部活跃的、持续性的高表达TF是易损斑块继发血栓形成的一个重要因素，并成为抗栓治疗药物干预的一个新靶点。正常情况下，血管内皮细胞并不表达TF，研究证实LPS、AngⅡ等可诱导内皮细胞表达TF，激活凝血反应，降低内皮细胞抗血栓的功能，而导致血栓形成。阮秋蓉［1］等研究表明，LPS(1 mg/L)可使人脐静脉内皮细胞TF活性增强约20倍。Nishimura［2］等研究表明，AngⅡ可增加大鼠主动脉内皮细胞TFmRNA的表达伴有TF活性升高导致血液促凝活性提高，容易引起动脉血栓的形成。我们的实验结果显示，RAEC未经LPS和AngⅡ刺激，只能检测到微量的TF，经LPS和AngⅡ刺激后，其TF表达增加。
TFPI是TF/FVIIa的抑制物，是一种存在于血液的天然抗凝物质，参与动脉粥样硬化和血栓形成过程，对调节血栓形成有重要作用，所以TFPI作为治疗血栓性疾病因子已深入研究。Tremoli等［3］证实血浆中提取的TFPI在血流模型中能抑制纤维蛋白形成。Haskel等［4］在对狗的实验中(该狗因股动脉损伤导致血栓形成)，应用组织纤溶酶原激活物和TFPI能阻止股动脉的再阻塞。在冠脉血栓的治疗中使用球囊扩张和放置支架、冠脉搭桥术后，冠脉再狭窄是一个主要难题，而阿司匹林、肝素仅能部分防止再狭窄，在这类患者中使用TFPI的潜在优势值得关注。Holst等［5］在兔颈静脉血栓形成模型中，人重组TFPI(rTFPI)减小血栓体积的效果与LMWH无明显差别，但rTFPI不导致出血，表明全身性应用TFPI可作为预防冠状动脉血栓及再狭窄的治疗手段。
氟伐他汀除了具有很好的调脂作用外，在预防心血管疾病中也发挥作用，主要是①改善内皮功能；②抗动脉粥样硬化，改善心肌缺血，减少冠心病的发生；③抑制平滑肌细胞的增生和迁移。黄全跃［6］等用不同剂量辛伐他汀观察对急性冠脉综合征患者TF和TFPI的影响，发现20 mg和40mg辛伐他汀短期治疗均能使组织因子活性降低，40 mg辛伐他汀使组织因子途径抑制物水平增高，提示他汀对组织因子和组织因子途径抑制物的作用可能是其抗栓机理之一。Ferrara［7］研究发现，氟伐他汀剂量依赖性的抑制抗磷脂抗体诱导的内皮细胞表达TF，抑制血栓形成，可用于治疗抗磷脂综合征中的血栓症。Atalar［8］用氟伐他汀治疗ACS的病人，来观察其对可溶的循环内皮蛋白c和自由TFPI的影响，发现氟伐他汀可明显增加病人的自由TFPI，证明对于ACS的病人，早期应用氟伐他汀治疗可取得有益的治疗效果。本实验以LPS和AngⅡ诱导RAEC释放TF，用不同浓度的氟伐他汀干预TF和TFPI，结果表明氟伐他汀可明显降低RAEC TF的表达，增加TFPI的表达。提示其抗血栓作用可通过抑制TF表达，增加TFPI表达，进而调节斑块破裂后的血栓形成而发挥作用。
参考文献
［1］ 阮秋蓉，宋建新，邓仲端，等.山蓑若碱对血管内皮细胞组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响及其机制研究［J］.中国西医结合">中西医结合杂志，2004，24(5)：422-425.
［2］ Nishimura H，Tsuji H，Masuda H，et al.Angiotensin Π increases plasminogen activator inhibitor-1 and tissue factor mRNA expression without changing that of tissue type plasminogen activator or tissue factor pathway inhibitor in cullured rat aortic endothelial cells［J］.Thromb Haemost，1997，77(6)：1189-1195.
［3］ Tremoli E，Camera M，Toschi V，et al.Tissue factor in atherosclerosis［J］.Ather-osclerosis，1999，144(2)：273-283.
［4］ Haskel EJ，Torr SR，Day KC，et al.Prevention of arterial reocclusion after thrombolysis with recombinant lipoprotein-associated coagulation inhibitor［J］.Circulation，1991，84(2)：821-827.
［5］ Holst J，Lindblad B，Berggvist D，et al.Antithrombotic effect of recombinant truncated tissue factor pathway inhibitor(TFPI1-161)in experimental venous thrombosis-acomparison with low molecular weight heparin［J］.Thromb Haemost，2003，71(2)：214-219.
［6］ 黄全跃，赵水平，吴洪光，等.不同剂量辛伐他汀对急性冠状动脉综合征患者组织因子和组织因子途径抑制物的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2005，13(5)：633-635.
［7］ Ferrara DE，Swerlick R，Casper K，et al.Fluvastating inhibits up-regulation of tissue factor expression by antiphospholipid antibodies on endothelial cells［J］.J Thromb Haemost，2004，2(9)：1558-1563.
［8］ Atalar E，Coskun S，Haznedaroglu IC，et al.Effects of Fluvastatin on Circulating Soluble Endothelial Protein C and free Tissue Factor Pathway Inhibitor in Acute Coronary Syndroms［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2005，19(3)：177-181.
3 讨论
TF即凝血因子III，是一个由263个氨基酸组成的低分子量(47kD)跨膜单链糖蛋白，作为外源性凝血途径的启动因子，它与凝血VII因子(FVII)结合形成复合体，使FVII激活成为有活性的FVIIa，启动凝血瀑布反应，形成凝血酶和纤维蛋白，导致血栓形成。在动脉粥样硬化斑块中，无论细胞成份还是非细胞成份中都存在TF。粥样硬化斑块中坏死脂质核心和高浓度的TF是强大的促凝物质，提示TF是动脉粥样硬化斑块脂质核心内的最重要的活性因子之一，在血栓的形成、启动和发展中起着重要作用。斑块破裂后形成血栓，导致冠状动脉完全或不完全性阻塞，从而产生冠状动脉的急性事件。全身或者斑块局部活跃的、持续性的高表达TF是易损斑块继发血栓形成的一个重要因素，并成为抗栓治疗药物干预的一个新靶点。正常情况下，血管内皮细胞并不表达TF，研究证实LPS、AngⅡ等可诱导内皮细胞表达TF，激活凝血反应，降低内皮细胞抗血栓的功能，而导致血栓形成。阮秋蓉［1］等研究表明，LPS(1 mg/L)可使人脐静脉内皮细胞TF活性增强约20倍。Nishimura［2］等研究表明，AngⅡ可增加大鼠主动脉内皮细胞TFmRNA的表达伴有TF活性升高导致血液促凝活性提高，容易引起动脉血栓的形成。我们的实验结果显示，RAEC未经LPS和AngⅡ刺激，只能检测到微量的TF，经LPS和AngⅡ刺激后，其TF表达增加。
TFPI是TF/FVIIa的抑制物，是一种存在于血液的天然抗凝物质，参与动脉粥样硬化和血栓形成过程，对调节血栓形成有重要作用，所以TFPI作为治疗血栓性疾病因子已深入研究。Tremoli等［3］证实血浆中提取的TFPI在血流模型中能抑制纤维蛋白形成。Haskel等［4］在对狗的实验中(该狗因股动脉损伤导致血栓形成)，应用组织纤溶酶原激活物和TFPI能阻止股动脉的再阻塞。在冠脉血栓的治疗中使用球囊扩张和放置支架、冠脉搭桥术后，冠脉再狭窄是一个主要难题，而阿司匹林、肝素仅能部分防止再狭窄，在这类患者中使用TFPI的潜在优势值得关注。Holst等［5］在兔颈静脉血栓形成模型中，人重组TFPI(rTFPI)减小血栓体积的效果与LMWH无明显差别，但rTFPI不导致出血，表明全身性应用TFPI可作为预防冠状动脉血栓及再狭窄的治疗手段。
氟伐他汀除了具有很好的调脂作用外，在预防心血管疾病中也发挥作用，主要是①改善内皮功能；②抗动脉粥样硬化，改善心肌缺血，减少冠心病的发生；③抑制平滑肌细胞的增生和迁移。黄全跃［6］等用不同剂量辛伐他汀观察对急性冠脉综合征患者TF和TFPI的影响，发现20 mg和40mg辛伐他汀短期治疗均能使组织因子活性降低，40 mg辛伐他汀使组织因子途径抑制物水平增高，提示他汀对组织因子和组织因子途径抑制物的作用可能是其抗栓机理之一。Ferrara［7］研究发现，氟伐他汀剂量依赖性的抑制抗磷脂抗体诱导的内皮细胞表达TF，抑制血栓形成，可用于治疗抗磷脂综合征中的血栓症。Atalar［8］用氟伐他汀治疗ACS的病人，来观察其对可溶的循环内皮蛋白c和自由TFPI的影响，发现氟伐他汀可明显增加病人的自由TFPI，证明对于ACS的病人，早期应用氟伐他汀治疗可取得有益的治疗效果。本实验以LPS和AngⅡ诱导RAEC释放TF，用不同浓度的氟伐他汀干预TF和TFPI，结果表明氟伐他汀可明显降低RAEC TF的表达，增加TFPI的表达。提示其抗血栓作用可通过抑制TF表达，增加TFPI表达，进而调节斑块破裂后的血栓形成而发挥作用。
参考文献
［1］ 阮秋蓉，宋建新，邓仲端，等.山蓑若碱对血管内皮细胞组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响及其机制研究［J］.中国中西医结合杂志，2004，24(5)：422-425.
［2］ Nishimura H，Tsuji H，Masuda H，et al.Angiotensin Π increases plasminogen activator inhibitor-1 and tissue factor mRNA expression without changing that of tissue type plasminogen activator or tissue factor pathway inhibitor in cullured rat aortic endothelial cells［J］.Thromb Haemost，1997，77(6)：1189-1195.
［3］ Tremoli E，Camera M，Toschi V，et al.Tissue factor in atherosclerosis［J］.Ather-osclerosis，1999，144(2)：273-283.
［4］ Haskel EJ，Torr SR，Day KC，et al.Prevention of arterial reocclusion after thrombolysis with recombinant lipoprotein-associated coagulation inhibitor［J］.Circulation，1991，84(2)：821-827.
［5］ Holst J，Lindblad B，Berggvist D，et al.Antithrombotic effect of recombinant truncated tissue factor pathway inhibitor(TFPI1-161)in experimental venous thrombosis-acomparison with low molecular weight heparin［J］.Thromb Haemost，2003，71(2)：214-219.
［6］ 黄全跃，赵水平，吴洪光，等.不同剂量辛伐他汀对急性冠状动脉综合征患者组织因子和组织因子途径抑制物的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2005，13(5)：633-635.
［7］ Ferrara DE，Swerlick R，Casper K，et al.Fluvastating inhibits up-regulation of tissue factor expression by antiphospholipid antibodies on endothelial cells［J］.J Thromb Haemost，2004，2(9)：1558-1563.
［8］ Atalar E，Coskun S，Haznedaroglu IC，et al.Effects of Fluvastatin on Circulating Soluble Endothelial Protein C and free Tissue Factor Pathway Inhibitor in Acute Coronary Syndroms［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2005，19(3)：177-181.