作者：段慧云， 张琳娜， 陈晓霞， 胡淑婷， 白洁
【摘要】 目的 探讨槐定碱致痫大鼠大脑皮质中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路相关蛋白的表达变化及其意义。方法 将42只健康SD大鼠随机分为正常组、癫痫组和苯巴比妥钠(phenobarbital sodium，PBS)治疗组。癫痫组腹腔注射槐定碱(Sophoridien，SRI)建立癫痫大鼠模型，应用免疫组化染色方法观察各组大鼠大脑皮质ERK1、ERK2和p-ERK1/2的蛋白水平表达变化，应用HE染色方法观察各组大鼠大脑皮质病理学改变。结果 正常大鼠皮质有少量的ERK1和ERK2表达；致痫0.5h后p-ERK1/2开始表达，并且 ERK1和ERK2阳性细胞数较正常组开始增多(P＜0.01)，致痫1.5 h 后三者表达数量达到最高值，5 h后表达下降；治疗组阳性细胞表达数量较癫痫组有一定程度的降低(P＜0.05)；与正常组和治疗组相比癫痫组大鼠皮质有明显的变性坏死神经元。结论 槐定碱致大鼠癫痫发作后，大脑皮质ERK的活性产生变化，其信号通路可能参与癫痫发作后皮质的病理生理反应过程。
【关键词】 癫痫；ERK信号转导通路；槐定碱；大鼠
槐定碱(Sophoridien，SRI)是从豆科槐树植物苦豆子中分离提纯出来的一种生物碱，属于四环的喹嗪啶类。据有关文献及本教研室前期实验研究发现大剂量的槐定碱有明显的中枢兴奋作用［1］，能引起反复癫痫发作，故利用槐定碱建立了一简单、稳定与人类癫痫相似的急性癫痫动物模型。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族的细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK1/2)在脑内含量丰富［2］，在神经元的胞体、树突上大量表达，可以将胞外刺激信号如神经递质、神经营养因子、神经生长因子等传至胞内，影响突触重塑、轴突生长和神经元的兴奋性，以及早期快反应基因表达，从而参与神经系统多种疾病的病理生理过程。本研究用槐定碱(SRI)诱发大鼠癫痫模型研究皮质ERK通路相关蛋白的表达，探讨ERK信号转导途径在癫痫发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组 健康SD大鼠42只(宁夏医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重180～220 g，随机分为正常组6只、癫痫组和苯巴比妥钠治疗组各18只，后两组按动物存活时间分为0.5、1.5和5 h组各6只。
1.2 药品、试剂与仪器 槐定碱(宁夏盐池制药厂生产，批号：021180)；苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司生产，批号：05070)；兔抗ERK1(Santa Cruz)、ERK2(Santa Cruz)和p-ERK1/2(Cell Signaling)和SP免疫组化染色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司；切片机为Leica公司产品，采用PL-A6XX Camera kit系统获取图像。
1.3 方法
1.3.1 模型制备 癫痫组腹腔注射槐定碱(47.83mg/kg)；治疗组预先腹腔注射苯巴比妥钠20mg/kg，0.5 h后按上述方法加注槐定碱。行为学观察按Racine分级标准，0级：正常行为状态；Ⅰ级：面肌抽动；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：单侧前肢阵挛；Ⅳ级：双前肢阵挛伴站立；Ⅴ级：持续站立，失去平衡、跌倒。从出现Ⅲ级发作开始计时，分别在0.5、1.5和5 h开始标本制备。
1.3.2 标本采集 各组大鼠于相应时间点经腹腔注射25%乌拉坦125mg/kg麻醉后迅速开胸暴露心脏，沿左心室向升主动脉插管并固定，先快速灌入生理盐水300mL冲洗血液，至右心耳流出无色透明液体时换4%多聚甲醛戊二醛混合溶液500 mL约1h进行内固定，四肢、尾阵挛直至僵直。断头取脑置入相同固定液中后固定24 h，石蜡包埋后作连续冠状切片，片厚5μm，每隔5张取2片，每例标本取片不少于8张。裱于经防脱片处理的清洁载玻片上待用。
1.3.3 免疫组织化学染色观察(SP法)和HE染色 免疫组织化学染色SP法按试剂盒说明进行操作，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性细胞数的计数方法为：每只大鼠取2张切片，两侧分别计数，每侧观察5个高倍视野，每个高倍视野计数大脑同一层面皮质阳性细胞数，以胞浆或胞核染成黄色或棕色为阳性，取其均值。此外每只大鼠各取一张切片按常规方法进行HE染色，光镜下观察。
1.4 统计学方法 数据以(±s)表示。用SPSS 13.0软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组动物行为学观察 正常组大鼠活动正常，治疗组表现安静，无癫痫发作。癫痫组大鼠在大剂量槐定碱腹腔注射后经6～10min的潜伏期后，开始出现须动、点头和咀嚼样动作，呈阵发性，至0.5h左右开始有面肌抽动、前肢阵挛、姿势失衡，继之发生全身强直，阵挛抽搐，跌倒，持续5min(18只均达到点燃标准)，常反复发作，2 h后大部分动物停止发作。
2.2 免疫组化染色检测 对照组大鼠大脑皮质有少量的ERK1和ERK2阳性神经元，未见p-ERK1/2阳性神经元。癫痫组在注射SRI 0.5h后皮质开始出现p-ERK1/2阳性神经元，同时ERK1和ERK2阳性神经元开始增多，1.5 h后ERK1、ERK2和p-ERK1/2阳性神经元表达数量达到最高值，5h后三者表达下降(P＜0.01)，治疗组阳性细胞表达量较癫痫组有一定程度的降低(P＜0.05)，见表1、图1(见封3)。
2.3 组织病理学观察 光镜观察HE染色标本，正常对照组大鼠皮质神经元呈圆形或椭圆形，细胞形态正常，核膜完整，核仁清晰可见。癫痫组大鼠脑组织坏死损伤区表现为细胞核固缩，核仁不明显，胞浆浓缩深染，以致痫1.5h损伤最重。治疗组皮质神经元排列整齐，形态完整，核圆形，偶见异常神经元(图2，见封3)。表1 各组癫痫发作前后大脑皮质ERK1、ERK2和p-ERK1/2免疫阳性细胞数
3 讨论
癫痫是一类严重危害人类健康的疾病。近年来研究发现，MAPK信号转导通路是又一种与癫痫关系密切的信号通路，该途径是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路。ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)成员的主要一员，是由Boultion等［3］在20世纪90年代初期先后分离鉴定的一种蛋白激酶，相对分子量分别为44kD和42kD，它们有90%的同源性。ERK1/2与其上游激活分子和下游效应分子组成一个准确高效的信号转导体系，以级联系方式将细胞信号逐步放大并传递至细胞内。ERK通路可以通过4条途径激活，活化的ERK1/2再激活转录因子或(和)P70核蛋白体S6激酶，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变从而调节细胞的代谢和功能。
ERK通路可能通过影响苔藓纤维重组、胶质细胞增生、突触重塑的机制参与癫痫的发病。既往报道颞叶/额叶/顶叶皮质、海马、齿状回、杏仁核复合体、梨状区、内嗅区和扣带回等区域的神经元和胶质细胞，均能表达ERK通路相关蛋白［4-6］。Zhao［7］等研究ERK1/2在痫性放电中的作用时证明，I型代谢性谷氨酸受体(ImGluR)通过酪氨酸酶依赖的过程激活ERK1/2，并且这种ERK 1/2的活化是海马内长时程痫样放电所必需的，这说明ERK1/2参与了致痫作用。Merlo研究发现，海马脑片经4-氨基吡啶(4-AP)孵育10～15min后神经元开始放电，20min后ERK1/2磷酸化到达高峰，持续2h仍高于正常30%，ERK1/2特异性抑制剂PD98059显著抑制了ERK1/2的活化，同时发作期放电完全消失，发作间期放电显著减少［8］。可见ERK参与了神经元同步化活动，其持续性活化可能由于持续性神经递质释放所致。本研究结果表明，正常组ERK1和ERK2在皮质各区域均有少量表达，p-ERK 1/2痫性发作后开始表达，痫性发作0.5h ERK 1/2表现明显活化，1.5h后表达最强。可见在槐定碱致痫模型中随着癫痫的发作皮质ERK通路逐渐被活化并参与癫痫的发作。Kv4.2是位于齿状回粒细胞和锥体细胞胞体和树突触后膜的一种快速失活的A型K+通道，有研究为ERK调节齿状回CA1区的锥体神经元Kv4.2，酸化的Kv4.2可使动作电位的放电频率和波幅增高，神经元兴奋性增强［9］。ERK通路可能通过调节突触前膜神经递质的释放而影响神经元的兴奋性。激活的ERK信号途径可以磷酸化兴奋性突触前膜的突触体素Ⅰ，导致谷氨酸(Glu)释放增加，从而促进痫性发作的发生［5］。
近年来，多数学者认为ERK1/2信号转导途径在癫痫发作中作为一种抗凋亡信号，有利于神经元存活［10-11］，本研究结果似乎也可以用这种观点来解释，但有研究表明ERK1/2途径底物CREB和p90RSK的表达和活性水平增强是癫痫后海马损伤的关键因素［12］。本研究显示，槐定碱致痫发作5h后ERK活化程度降低但未回到基本水平，由于ERK通路的主要功能对细胞增殖、分化与维持存活至关重要。因此，可以推想给予SIR致痫后ERK的持续磷酸化可能是细胞遭受该种损害后的一种内在保护性机制。本实验还显示，应用传统的苯巴比妥钠抗癫痫药物，不仅抑制了癫痫行为学的发作，而且还可一定程度上减少该路径中ERK的活化。另有学者报道，在用KA致痫模型研究海马组织对癫痫耐受机制时，观察到急性的痫样发作后ERK迅速活化，PD98059干预后不仅抑制该路径中ERK的活化，也显著减弱了癫痫早期CA3区神经元自身的保护反应［13］。本实验并没有应用特殊的抑制剂，ERK阻断剂是否有效抑制癫痫的发作，对兴奋性毒性损伤的神经元有无保护作用有待在今后的工作中进一步研究。
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