TNF-α基因多态性与宁夏汉族煤工尘肺的关系

　　　　 作者：杨文海，王发选，杨瑾，宋琦如

【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α308位点）基因多态性与宁夏汉族煤工尘肺（CWP）患者的关系。方法 对宁夏神华煤业集团所属煤矿已确诊的110例煤工尘肺病例与110例接尘对照者和110例非接尘对照者进行研究(本文研究对象均为汉族)，采用聚合酶链反应-限制片断长度多态(PCR-RFLP)分析TNF-α基因中-308G/A多态性位点。结果 煤工尘肺组［（48.30±13.16）岁］与煤尘接触组［（43.86±4.20）岁］和非煤尘接触组［(41.73±5.45)岁］ 间年龄差异有统计学意义（P＜0.01）；煤工尘肺组和煤尘接触组之间接尘工龄（t=0.47，P＝0.64）、主掘进工和主采煤工所占比例、吸烟烟龄等差异均无统计学意义; TNF-α-308G/A基因型在煤工尘肺组和煤尘接触组及非煤尘接触组中所占比例分别为35.45％、23.60％、18.20％；等位基因频率A在煤工尘肺组和煤尘接触组及非煤尘接触组中所占比例分别为20.46％、13.6％、10.01％；TNF-α-308G/A基因型与等位基因频率分布差异有统计学意义。结论 肿瘤坏死因子-α基因型-308位点可能与宁夏煤工尘肺病的发生有关。

【关键词】 煤工尘肺；肿瘤坏死因子-α；聚合酶链反应-限制片断长度多态性；基因多态性

　　Abstract: Objective To investigate the relationship between gene polymorphisms of Tumor necrosis factorαand coal worker pneumoconiosis. Methods In a prospective study of 110 patients with CWP and 110 controls， TNFα308G/A genotypes were measured using PCRrestriction fragment length polymorphism. Results The average age of coal worker pneumoconiosis group was 48.30±13.16， and they were 43.86±4.20 and 41.73±5.45 yrs in coal dust exposure group and nondust exposure group respectively. No significantly difference was found in Dust length of service，the main tunneling work，age of smoking cigarettes. TNFαin CWP patients were significantly higher than that in controls (P＜0.05). TNFα308G / A genotype accounted by 35.45％，23.60％，18.20％ in coal worker pneumoconiosis group， coal dust exposure group and nondust exposure group respectively. Allele frequency of A was 20.46％，13.6％，10.01％ in coal worker's pneumoconiosis group ，dust exposure group and noncoal dust exposure group respectively. Significant difference between CWP patients and controls was found in frequencies of TNFα308G/A genotypes and alleles (P＜0.05). Conclusion TNFα may be related to CWP patients in Ningxia.

　　Key words:coal worker pneumoconiosis;tumor necrosis factorα; PCRrestriction fragment length polymorphism; polymorphism

　　煤工尘肺（coal worker pneumoconiosis ，CWP）是指煤矿粉尘作业工人长期吸入生产性粉尘所引起的尘肺的总称［1］。目前，尘肺成为我国发病率最高、死亡危险性较大、对劳动者危害最严重的一类职业病。煤工尘肺作为尘肺病中最常见的一种，占尘肺病总数的一半以上［1-2］。目前，流行病学研究表明，遗传因素在尘肺病的发生、发展中可能也有一定作用。此次研究探讨其基因多态性与宁夏汉族人群煤工尘肺发病的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　以宁夏神华煤业集团所属煤矿已确诊的尘肺病例中的110例为病例组、均为汉族男性病例，选择抽取与病例年龄相差不超过2.5岁，同性别、同工种、同民族，相同的开始接尘年代及累积接尘工龄（±2年）的接尘对照人群110例作为煤尘接触组，选择抽取当地居民年龄与病例组年龄相差不超过±2.5岁的汉族男性但不接尘的对照110例作为非煤尘接触组；病例组和两个对照组均无其他免疫病史及其他肺部疾病。并对煤工尘肺组和煤尘接触组及非煤尘接触组中的研究对象进行问卷调查，内容包括：年龄、接尘工龄、尘肺病诊断史、既往病史等。同时对研究对象拍摄X线（后前位）胸片，由专家组按《尘肺病诊断标准》（GBZ70－2002）进行诊断（煤工尘肺病例应出具诊断证明书并确定为煤工尘肺病例）。
　　
　　1.2 血样采集和DNA提取

　　每个研究对象采集外周静脉血3～5mL，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的真空无菌管中混匀，及时置于－20℃冰箱中保存，采用氯仿抽提结合乙醇沉淀的方法从外周静脉血中提取DNA。

　　1.3 TNF-α308位点基因多态性分析

　　结合文献设计引物［3］，其序列如下：上游引物为5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'；下游引物为5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’；由北京奥科生物技术有限责任公司合成，其扩增的DNA片段长度为107bp；PCR 反应条件为95℃ 5min、95℃ 30s、60℃ 1min、72℃ 1 min、35个循环、72℃ 7min，10μL PCR 反应产物与10U限制性内切酶Nco I在37℃条件下隔夜消化，经质量分数为3％ 的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，用凝胶成像系统观察并记录实验结果。

　　1.4 质量控制

　　采用统一的调查表，调查员经过统一培训、能够保证态度认真，调查员在调查时对病例和对照一视同仁，以减少调查员偏倚。通过“接尘工人管理登记卡”记录病例和对照的职业史、尘肺诊断情况，以减少被调查者的回忆偏倚和报告偏倚。所选择研究对象来自于两个不同现场，一定程度上减少了选择偏倚。

　　1.5 统计学方法
　　
　　所有数据均以(±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间各指标比较采用方差分析，两组间等位基因计数资料用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　见表1。表1 煤工尘肺病例组与对照组的基本情况（略）

　　煤工尘肺组和煤尘接触组之间接尘工龄（t=0.47，P＝0.64）、主掘进工和主采煤工所占比例、吸烟烟龄等差异均无统计学意义; 煤工尘肺组和煤尘接触组之间、煤工尘肺组和非煤尘接触组年龄差异有统计学意义（P＜0.01）。

　　2.2 TNF-α308位点基因多态性分布情况 见图1、2 。

　　Marker为600/500/400/300/200/100；LANE 1为GA杂合子（107、87、20）；LANE 2，3，4，5为GG纯合子（87、20）；LANE 6，8为AA纯合子（107）；LANE 7 Marker图1 目的片段扩增（PCR）电泳图图2 TNF-α基因启动子区308位点酶切图2.3 各组TNF-α308位点基因型及等位基因频率比较 经遗传平衡定律检验，符合Hardy-Weinberg平衡法则，表明基因型频率已达遗传平衡，所选择群体具有群体代表性。利用基因直接计数法，据基因型分别计算多态位点的基因频率，TNF-α基因-308位点在不同组间分布结果见表2 。经卡方检验病例组与煤尘接触组等位基因频率差异有统计学意义(P＜0.05)；煤尘接触组与非煤尘接触组差异无统计学意义(P=0.58)；等位基因A的频率煤工尘肺组I期与III期差异有统计学意义(P＜0.01)。表2 各组中TNF-α基因-308位点的基因型及等位基因频率的分布（略）

　　3 讨论

　　TNF-α编码基因位于6p21.3，为介于HLA-DR以及HLA-B位点之间的HLA-Ⅲ类抗原基因簇。Kroeger等［4］发现TNF-α基因-308位点的基因多态性可直接影响TNF-α的表达产量，-308A的转录活性高于-308G。

　　此次研究由表中结果显示， TNF-α-308位点G/A+A/A基因型分布频率在宁夏煤工尘肺患者和煤尘接触人群中有统计学意义，提示该位点基因多态性在宁夏煤工尘肺发病的遗传易感因素中可能起作用。煤工尘肺按照诊断分期后，该位点变异基因型(G/A+A/A)分布频率在煤工尘肺Ⅲ期患者中有一定程度的增高，为34.79%，高于Ⅰ、Ⅱ期煤工尘肺患者和煤尘接触者。变异基因型携带者比G/G基因型更容易发展成Ⅲ期煤工尘肺。此结果提示该位点的基因多态性和煤工尘肺肺纤维化严重程度可能有关。Kim等［5］对韩国煤工尘肺的研究结果与此基本一致；但是也有相反的观点，李霖等研究认为：TNF-α-308位点G/A+A/A基因型分布频率在中国汉族煤工尘肺患者和煤尘接触人群中差异无统计学意义，该位点基因多态性在中国汉族煤工尘肺发病的遗传易感因素中不起重要作用［6］。TNF-α-308位点基因多态性与COPD、肺癌、煤工尘肺关系的病例对照研究已有报道，但研究结果并不一致［7-9］。此次研究结果中TNF-α-308A分布频率与国外研究结果比较：Yucesoy B 等［10］对高加索人的研究结果为矽肺患者中占30％、矽尘接触者为27％；Corbett EL 等［11］对南非黑种人的研究结果为矽肺患者中占23％、矽尘接触者为24％；Kim KA 等［5］对韩国人的研究结果为煤工尘肺中占20.6％、非煤尘接触组中为10.2％；李霖等［6］研究结果为煤工尘肺中占10.68％、煤尘接触组中为10.91％；而此次研究结果为煤工尘肺中占20.46％、非煤尘接触组中为10.01％。这可能与人种、民族、地域等差异有关 ，也可能与研究方法有关。以往采用的都是整群对照研究；本次研究采用 1∶1 配比的病例对照研究 ， 对影响尘肺发生发展的环境因素和个体因素进行了严格匹配 ， 控制了各种混杂因素的干扰。
　　
　　总之，此次研究结果表明，TNF-α-308位点基因多态性在宁夏地区煤工尘肺发病的遗传因素中可能有作用，且TNF-α-308位点基因多态性与煤工尘肺的严重程度有关。

参考文献

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　　［11］Corbett E， Mozzato-Chamay N， Butterworth A，et al.Polymorphisms in the tumornecrosis factor-alpha gene promoter may predispose to severe silicosis in black South African miners［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165(5):690-693.