作者：张金添， 黄汉兴， 吴永廉
【摘要】 目的观察CyclinE在食管鳞状细胞癌和癌周正常食管组织的表达，从量化角度阐明其在食管鳞状细胞癌组织中表达的病理学意义。方法 常规石蜡包埋、HE切片确诊，免疫组化MaxVision法检测CyclinE在食管鳞状细胞癌和癌周正常食管组织的定位和表达，Image-pro plus图像分析软件对其表达强度进行定量分析，并用表达的阳性单位(positive unit，PU)反映其表达强度。结果 CyclinE蛋白在食管鳞状细胞癌和癌周正常食管组织中的表达主要定位在细胞核。食管鳞状细胞癌表达的PU值高于癌周正常食管组织(P&<0.01)，CyclinE蛋白表达的PU值与食管癌分化程度有关(P&<0.01)，低分化鳞状细胞癌表达的PU值高于高分化及中分化鳞状细胞癌。CyclinE蛋白表达的PU值与食管癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期未见明显相关性(P&>0.05)。结论 CyclinE蛋白表达程度与食管鳞状细胞癌及分化程度具有相关性，可能成为判断其指标之一。
【关键词】 食管癌;CyclinE;免疫组化;定量分析
细胞周期蛋白E(CyclinE)在多种肿瘤中有基因过表达，对肿瘤的发生发展起重要作用，已被证实是一种癌基因[1-2]。本研究拟通过原位定量检测CyclinE蛋白的表达，从量化角度揭示其在食管鳞状细胞癌中的表达特点，阐明其与食管鳞状细胞癌分化程度、转移和分期的关系，探索其在食管鳞状细胞癌中表达的意义。
1 材料和方法
1.1 材料及分组 收集福建省莆田市第一医院病理科资料完整的原发性食管鳞状细胞癌手术切除标本(术前未经治疗) 54例，其中男37例，女17例，年龄最小43岁，最大80岁，平均61岁;高分化19例，中分化22例，低分化13例;淋巴结转移者26例，无淋巴结转移者28例;TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期19例。同时取20例癌周正常食管组织(距肿物5cm以上)做为正常对照。所有标本经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片(厚度4μm)、HE染色。
1.2 免疫组织化学染色 免疫组化采用MaxVision法。一抗为鼠抗人CyclinE单克隆抗体(即用型)、MaxVision试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。主要步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，1mmol·L-1、pH6.0柠檬酸高压修复抗原1.5min，3%h3O2室温孵育10min，以清除内源性过氧化物酶活性，滴加一抗室温孵育60min;滴加二抗室温孵育15min，DAB显色5min;不复染(用于图像定量分析)，脱水、透明、封固。每批免疫组化染色均设立阳性和阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。
1.3 显微图像定量分析 根据阴性和阳性对照的显色情况，在确定无假阳性和假阴性的前提下，以细胞核染成浅黄色、棕黄色或棕褐色为阳性。用Image-pro plus图像分析系统，在40倍物镜下，每例样本随机选取10个视野，共测试200个阳性细胞，用交互式测试方法测试每个阳性细胞的灰度值为Gβ，同时在相应的切片中测试背景灰度值Gα，按下式计算每个阳性细胞的阳性单位值， 本图像分析系统中的Gmax为256，取每个样本中200个阳性细胞值的均值作为此样本表达的阳性单位值(Positive Unit， PU)。PU 值越大，表达强度越高; 反之，表达强度越低。
PU=|Gα-Gβ|Gmax×100
1.4 统计学方法 用SPSS11.0统计分析软件进行数据处理， 采用两样本t检验和方差分析，以P&<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
CyclinE染色主要在细胞核内，染色呈浅黄色、棕黄色、棕褐色为阳性细胞(图1，见封3)。
2.1 CyclinE在食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜上皮细胞核中的表达 食管鳞状细胞癌和正常食管细胞的CyclinE蛋白表达程度不同(8.37±3.86 PU，3.29±2.03 PU)，二者差异有统计学意义 (t=7.317，P&<0.01)。
2.2 CyclinE在不同分化程度食管鳞状细胞癌癌细胞核中的表达
CyclinE蛋白在不同分化程度的食管鳞状细胞癌呈阳性表达，但其表达程度不同，CyclinE蛋白表达的PU值在高分化、中分化和低分化食管鳞状细胞癌间总体比较的差异有统计学意义(P&<0.01)，其中高分化食管鳞状细胞癌组及中分化食管鳞状细胞癌组CyclinE蛋白表达的PU值显著低于低分化食管鳞状细胞癌组(P&<0.05)，见表1。表1 CyclinE在不同分化程度食管鳞状细胞癌细胞中的表达组别nPU值(±s)
2.3 CyclinE蛋白表达与食管癌患者性别、年龄、淋巴结转移、TNM 分期的关系
CyclinE蛋白表达的PU值与食管癌患者的性别、年龄、淋巴结转移、TNM分期无关，见表2。表2 CyclinE在食管鳞状细胞癌中表达的PU值
3 讨论
肿瘤作为以细胞生长和增殖失控为主要特征的疾病，细胞在增殖、分化和凋亡方面的异常都参与了肿瘤的发生、发展，其中细胞周期调控失调是肿瘤发生、发展的最主要机制。近年来随着细胞周期研究的深入，发现并确立了丝氨酸、苏氨酸激酶家族在细胞周期调控中的核心作用。这一家族包括周期蛋白(Cyclins)和周期蛋白依赖激酶(Cycin dependent kinase，CDK)。CyclinE是1997年由Koff等发现的[3]，其基因定位于19q12~19q13，包含4个外显子及3个内含子。CyclinE含有一个高度保守中心区，称为周期蛋白盒，能与CDK结合。CyclinE的表达随细胞周期波动，于G1晚期或S早期达高峰，之后迅速下降，G2和M期无表达，主要是与周期性合成与降解有关。CyclinE第380位苏氨酸的自身磷酸化可调节CyclinE降解。在G1期CyclinE可与CDK2结合形成CyclinE/ CDK2复合物， 该复合物的浓度是细胞通过G1~S调节点的最关键因素， 可引起底物(如pRB等)进一步磷酸化，释放转录因子E2F，使DNA合成得以进行，细胞由G1期进入S期，是G1~S期转化的主要限制因子[4]。CyclinE的过度表达能加速G1~S期转化，促进细胞增殖。CyclinE基因失调、蛋白过量表达可见于胰黑色素瘤、卵巢癌、大肠癌等多种肿瘤中[5-8]， 证明是一种癌基因。
已有的研究表明，CyclinE基因的表达在食管肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。张晓丽等[9]研究发现CyclinE从正常上皮、增生上皮到鳞状细胞癌，随着病变发展其阳性表达率逐渐增多，同时高分化鳞状细胞癌组阳性表达率显著低于低分化鳞状细胞癌组，淋巴结转移组CyclinE阳性表达率高于淋巴结无转移组。然而Anayama等[10]对食管癌中的CyclinE基因表达的研究发现，其与临床病理参数无关;Matsumoto等[2]认为CyclinE与肿瘤预后无明显关系。CyclinE在食管癌中高表达，但目前尚未确定CyclinE与食管癌临床病理参数及预后的关系。
本研究应用图像分析软件测试食管癌癌细胞核CyclinE表达的显色反应强度，区别于上述文献中的阳性表达百分率[9-10]，结果显示: ①在正常食管黏膜上皮细胞CyclinE的表达程度显著低于在食管鳞状细胞癌中的表达(P&<0.01)，提示CyclinE蛋白的过度表达可能与食管鳞状细胞癌的发生有关。②CyclinE的表达程度与食管鳞状细胞癌病理分级相关(P&<0.05)，随着肿瘤分化程度的降低，恶性程度的升高， CyclinE的表达程度增加，提示CyclinE的高表达与肿瘤细胞的分化和恶性程度相关。③CyclinE在食管鳞状细胞癌中的表达与淋巴结转移及TNM分期无关，可能是肿瘤发生的早期事件。④CyclinE蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者性别、年龄的无关，说明其表达不受患者患者性别、年龄的影响。
本研究结果显示CyclinE在食管鳞状细胞癌的发生、分化中发挥作用，CyclinE蛋白在食管鳞状细胞癌与正常食管中表达程度不同，同时其在不同分化程度的食管鳞状细胞癌中表达程度也不同，提示CyclinE蛋白表达程度可作为食管鳞状细胞癌诊断、分级诊断的辅助指标之一，对临床诊断食管癌有一定帮助。
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