【摘要】 目的探讨还原型谷胱甘肽干预高同型半胱氨酸血症致兔动脉粥样硬化的机制。方法将44只新西兰白兔随机分为4组：对照组以标准饲料100 g·d-1喂养，模型组以1%蛋氨酸饲料100 g·d-1喂养，低剂量药物组以1%蛋氨酸饲料100g·d-1喂养+还原型谷胱甘肽15mg·d-1肌注，高剂量药物组以1%蛋氨酸饲料100g·d-1喂养+还原型谷胱甘肽30mg·d-1肌注。于实验前和实验8周后耳中央动脉采血检测Hcy、TC、TG、CRP、SOD并对结果进行分析。结果模型组Hcy水平高于对照组，差异有统计学意义(P&<0.05); 模型组SOD活性降低，与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05);模型组CRP值高于对照组，差异有统计学意义(P&<0.05);经还原型谷胱甘肽治疗，模型组IMT高于对照组(P&<0.05);低剂量药物干预组IMT较对照组有所增厚(P&<0.05);高、低剂量药物干预组IMT与模型组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。结论还原型谷胱甘肽通过抑制氧化应激、炎症反应阻止动脉粥样硬化的发生、发展。
【关键词】 还原型谷胱甘肽;高同型半胱氨酸血症;动脉粥样硬化
动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是多种心血管疾病的病理基础。近年来多项研究表明高同型半胱氨酸血症(HHcy)是动脉粥样硬化的独立危险因素[1]。现阶段研究治疗HHcy的方法主要使用叶酸和B族维生素，但是，叶酸及B族维生素的常用治疗剂量不足以使同型半胱氨酸浓度降至引起心血管疾病的危险水平以下，而且远期疗效不确定。本研究旨在观察HHcy引起AS的机制，证实内源性拮抗高同型半胱氨酸血症药物-还原型谷胱甘肽降低血清同型半胱氨酸的作用及机制，为高同型半胱氨酸血症所致动脉粥样硬化的治疗提供新方法。
1材料与方法
1.1动物普通级雄性新西兰白兔44只，体重2.0～2.5kg，3～4个月龄，由四川省医学科学院实验动物研究所提供(SCXK川2008-15)适应性喂养15d。
1.2试剂还原型谷胱甘肽注射液(商品名阿拓莫兰注射液0.6g·瓶-1)由重庆药友制药有限公司提供;蛋氨酸购自武汉远城科技发展有限公司;同型半胱氨酸检测试剂盒购自北京九强生物技术有限公司;SOD试剂盒购于南京建成公司。TC、TG、CRP由银川市第一人民医院检验科测定。
1.3仪器奥林巴斯AU640 全自动生化分析仪，B300低速台式离心机，GEvivid7超声仪。
1.4方法将普通级雄性新西兰白兔44只随机分为4组，每组11只。对照组标准饲料100 g·d-1喂养;造模组以1%蛋氨酸饲料100 g·d-1喂养;低剂量药物干预组以1%蛋氨酸饲料100 g·d-1喂养+还原型谷胱甘肽15mg·d-1肌注;高剂量药物干预组以1%蛋氨酸饲料100 g·d-1喂养+还原型谷胱甘肽30mg·d-1肌注。还原型谷胱甘肽连续注射8周。以上各组不限饮水。实验开始前由耳中央动脉采血6mL，立即以3000r·min-1离心10min，取上清液 -80℃冻存备用，8周后结束实验，同样方法冻存血清备测。实验8周末，使用美国GE VIVID7彩色多普勒超声诊断仪，血管探头频率为7~10MHz，进行血管超声检查测量兔腹主动脉内-中膜厚度( IMT)及大体形态。空气栓塞处死动物，取降主动脉至髂总动脉分叉处血管，10%甲醛固定、取材、石蜡切片、HE染色光镜观察，图像分析系统测量动脉内中膜厚度。
1.5统计学方法各组数据用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析，各组间数据使用LSD-T检验，采用直线相关分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组兔血清HCY比较
0周时各组兔血清HCY水平分布符合正态分布，其95%的可信区间为17.48～29.80μmol·L-1，超过此值上限确定为兔高同型半胱氨酸血症。0周时各组动物HCY水平差异无统计学意义(P&>0.05);8周末模型组HCY高于对照组 (P&<0.05);高、低剂量药物干预组与模型组比较HCY水平下降(均P&<0.05);高剂量药物干预组HCY水平又低于低剂量组(P&<0.05)，见表1。表1血浆中同型半胱氨酸的含量
2.2各组兔血清TC、TG比较
0周时各组兔血脂水平差异无统计学意义(P&>0.05)，TG95%医学参考值范围为0.89～1.39mmol·L-1，TC95%医学参考值范围为0.92～1.44mmol·L-1。造模后8周模型组兔血清TC、TG明显高于对照组(P&<0.05);第8周末高、低剂量药物干预组TC、TG水平与模型组比较明显降低(P&<0.05);第8周末高、低剂量药物干预组TC、TG水平之间比较，差异无统计学意义(P&>0.05)，见表2。表2血浆中甘油三酯、胆固醇的含量
2.3各组SOD、hs-CRP比较
实验8周后检测SOD、hs-CRP水平，模型组SOD活性低于对照组(P&<0.05);高、低剂量药物干预组SOD活性均高于模型组(P&<0.05)，但低剂量组SOD活性仍低于对照组(P&<0.05)，而高剂量组已接近对照组(P&>0.05);高剂量组SOD活性高于低剂量组(P&<0.05)。模型组、高、低剂量药物干预组hs-CRP水平均高于对照组(P&<0.05);高、低剂量药物干预组hs-CRP水平均低于模型组(P&<0.05);高、低剂量药物干预组之间比较，高剂量组hs-CRP水平低于低剂量组(P&<0.05)，见表3。表3血浆中SOD、CRP
2.4各组兔腹主动脉超声和病理切片图像分析结果
实验8周末超声检查各组腹IMT，模型组IMT高于对照组(P&<0.05);低剂量药物干预组IMT较对照组有所增厚(P&<0.05);高剂量药物干预组与对照组之间IMT比较差异无统计学意义(P&>0.05);高、低剂量药物干预组IMT之间比较差异有统计学意义(P&<0.05);高、低剂量药物干预组IMT与模型组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。实验8周末各组腹主动脉病理切片显微镜下使用图像分析系统测量IMT，模型组IMT高于对照组(P&<0.05);低剂量药物干预组IMT较对照组有所增厚(P&<0.05);高剂量药物干预组与对照组之间IMT比较，差异无统计学意义(P&>0.05);高、低剂量药物干预组IMT比较差异有统计学意义(P&<0.05);高、低剂量药物干预组IMT与模型组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)，见表4。表4超声及图像分析系统检测血管内中膜厚度
2.5同型半胱氨酸与其它指标的相关性分析
实验8周末血清中Hcy水平与其它各指标采用多元相关分析，结果血清Hcy水平与SOD、hs-CRP存在明显相关性(P&<0.05);TC、TG与Hcy无相关性(P&>0.05)，见表5。
2.6各组兔腹主动脉光镜下观察
标本在400倍光镜下可见对照组血管壁三层结构清楚，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐，内皮下未见脂质及泡沫细胞。模型组可见内膜明显增厚，内膜下有排列不规则平滑肌细胞(SMC)，内有脂质沉积，形成大小不等、形态不规则的泡沫细胞。高低剂量药物干预组虽然有内膜增厚及极少泡沫细胞出现但是较模型组明显减轻，见图1～4(封2)。表5HCY与各项指标的相关性
3讨论
Hcy是一种含硫的人体非必需氨基酸，是蛋氨酸在人体内的代谢产物，其主要通过以下三个途径代谢[2]：1)再甲基化途径;2)转硫化途径;3)直接释放到细胞外。上述三个途径任何一个途径出现代谢障碍时均可导致人体内同型半胱氨酸蓄积并达到高同型半胱氨酸血症水平。本实验结果显示，HHcy可以导致动脉粥样硬化的产生。经过相关性分析发现SOD与Hcy呈负相关，其相关系数的绝对值高于其它因素，说明Hcy可通过氧化应激反应引起AS。CRP与Hcy也有相关性，说明炎症免疫反应也是Hcy引起AS的一个作用机制。经过相关性分析表明血脂与Hcy没有相关性，说明Hcy没有直接引起血脂异常。单纯叶酸或叶酸与维生素B6、维生素B12合用，或维生素B6、维生素B12合用都有降低同型半胱氨酸浓度的作用[3]，但是有实验证明补充叶酸、维生素B12对降低血清Hcy浓度有意义，但对Hcy引起的内皮细胞受损、炎症和免疫反应有无阻断作用及远期疗效，需进一步临床观察[4-5]，而且大剂量使用B族维生素可使外周神经变性[6]。对于治疗降低Hcy浓度后能否降低心脑血管疾病的危险性，尚缺少临床试验提供循证医学证据，故目前仍不建议所有高Hcy病人都接受叶酸、维生素治疗来预防心脑血管疾病[7-8]，需要研究新的方法来干预、治疗动脉粥样硬化的发生、发展。本实验结果表明还原型谷胱甘肽(GSH)升高SOD活性作用，以及降低炎症因子水平是随着GSH使用剂量大小而增加的，说明GSH抗氧化作用、抑制炎症反应是呈剂量相关性的。综上分析表明，Hcy可以通过氧化应激、炎症反应引起血脂异常最终导致动脉粥样硬化的发生，本实验模型组的Hcy水平持续8周可引起动脉粥样硬化的早期表现，可能随时间的延长动脉粥样硬化的程度会加剧。还原型谷胱甘肽可能通过抑制氧化反应和炎症反应，降低高同型半胱氨酸血症，阻止动脉粥样硬化的发生发展。
参考文献
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