作者：侯延辉， 杨建宏， 陈通， 孙磊
【摘要】 目的 优选秦艽的最佳提取工艺。方法 采用正交试验法，以提取物中的龙胆苦苷为考察指标，对影响龙胆苦苷提取工艺的因素进行了研究。结果 龙胆苦苷的最佳提取工艺为 50%乙醇，8倍量，回流提取3次，每次1h。结论 该工艺下的秦艽龙胆苦苷含量提取可达6.3%。
【关键词】 正交试验; 秦艽; 龙胆苦苷; 提取工艺
秦艽为龙胆科植物秦艽(Gentianna macrophylla Pall)、麻花秦艽(G.straminea Maxim) 、粗茎秦艽(G.crassicaulis Duthieex Burk) 或小秦艽(G. dahurica Fisch)的干燥根[1]，是我国重要的传统中药， 具有祛风湿，清湿热，止痹痛的作用，用于风湿痹痛，筋脉拘挛，骨节酸痛，日哺潮热，小儿疳积发热等，主产于陕西、甘肃、宁夏、四川、内蒙古，陕西、甘肃两省是其地道产区 [2]。秦艽主要含有裂环环烯醚萜苷类、生物碱、甾醇苷类等[3]。龙胆苦苷属于裂环环烯醚萜苷类，是秦艽的主要活性成分。本次实验根据回流提取方法，就秦艽龙胆苦苷在提取溶剂浓度、溶剂用量、提取时间、提取次数四方面进行四因素三水平的正交设计并通过HPLC对提取物中龙胆苦苷进行含量测定，来确定中药材秦艽中龙胆苦苷的最佳提取工艺。
1 仪器及试药
1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)、F W135型中药材粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)、210电子分析天平(日本岛津)、RE-52A真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、HH.SYII-NiZ-C电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂)、SHB-III循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、WFO-700W送风定温干燥箱(上海爱郎仪器有限公司)。
1.2 试药 秦艽中药材(购自宁夏明德饮片有限公司)、龙胆苦苷标准品(购自中国药品生物制品检定所)、甲醇为色谱纯(天津市瑞金特化学品有限公司)、乙腈为色谱纯(天津福晨化学试剂厂)、无水乙醇为分析纯(天津市盛奥化学试剂有限公司)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
流动相为乙腈∶甲醇∶水(4∶5∶16)，色谱柱为C18柱(250 mm×4.6mm)，流速为1.0mL·min-1，检测时限为21min，检测波长271nm，在该色谱条件下龙胆苦苷有较好的分离，见图1、2。
图1 龙胆苦苷对照品
图2 龙胆苦苷供试品
2.2 正交设计
根据工艺，确定(A)乙醇浓度、(B)乙醇用量、(C)提取次数(时间)作为考察的3个因素，以龙胆苦苷含量(依据中国药典2005年版一部秦艽含量测定项下方法)作为考核指标，选用L9(34)正交表进行实验，见表1。表1 因素与水平
2.3 对照品溶液制备
将标准品储备液(0.51mg·mL-1)稀释10倍(0.051mg·mL-1)，即得标准品溶液。
2.4 样品溶液制备
精密称取提取物适量，用甲醇溶解，并定容至5mL，根据标准品线性范围，稀释至适当浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品使用。
2.5 标准曲线的制备
将稀释后的标准品溶液通过微孔滤膜滤过后，分别以5、7.5、12.5、15、17.5μL进样。以峰面积(A)对进样体积(VμL)进行线形回归， 得回归方程y=838523x+70242，r=0.9995，结果表明在0.2550～0.8925μg范围内，龙胆苦苷的含量与其峰面积具有良好的线形关系。
2.6 正交实验及结果分析
2.6.1 直观分析
以龙胆苦苷含量为指标，通过实验结果，对乙醇浓度、提取次数、乙醇用量进行直观分析(见表2)。表2 正交设计直观分析
2.6.2 方差分析
以龙胆苦苷含量为测量指标，对正交试验结果进行方差分析，分析结果见表3。表3 方差分析方差分析结果表明：FB、FC均小于F0.05，均无统计学意义。
3 讨论
由直观分析结果表明：RB&>RC&>R误差&>RA。各因素显著性为乙醇用量(B)&>提取时间(C)&>乙醇浓度(A)，实验采用50%、60%、70%乙醇对秦艽龙胆苦苷进行提取，通过对最终结果的直观分析，发现不同乙醇浓度对秦艽中龙胆苦苷的提取无统计学意义，故乙醇浓度可根据实际情况，如经济情况、试验条件等选用。而且，对于B因素，由于Ⅰ平均ⅲ﹥Ⅰ平均ⅰ﹥Ⅰ平均ⅱ，所以B因素取第三水平，同理，C因素取第三水平，A因素取第一水平。所以通过本次试验可以得出，宁夏六盘山秦艽最佳提取工艺为A1B3C3，即50%浓度乙醇，体积为药材质量的8倍量，提取3次，每次1h，该工艺下的秦艽龙胆苦苷含量提取可达6.3%。
另外，通过对相关文献的查阅发现，温度对秦艽龙胆苦苷含量也有很大的影响[4]，但本次试验涉及的三种浓度乙醇沸点相差不大，因此在本次实验中，秦艽龙胆苦苷的提取可以认为是在等温条件下进行的。同时，本次试验基于从工业生产安全、经济角度出发，所以只是运用了乙醇进行提取，如果改变温度、改变提取试剂如甲醇、氯仿等，其提取结果是否会有很大的差异，因此选取合适的试剂和合适的提取温度以提高龙胆苦苷的含量，这需要进一步去探索研究。
参考文献
[1] 中华人民共和国国家药典委员会[S].中国药典，2005.
[2] 李向阳，李福安，李建民.青海省野生和栽培秦艽中龙胆苦苷的含量比较[J].华西药学杂志，2005，20(2):137.
[3] Sun NJ， Xia CF. Study on the chemical constituents from Gentiana rigescens[J].Chin Herb Bull， 1984， 9(1):33-34.
[4] 高娟.秦艽炮制研究[D].西北大学硕士论文，2006:2-20.