作者：杨雪炎 熊兵红 马利 程勇
【关键词】 宫颈癌 微转移检测 研究进展
宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二种最常见的恶性肿瘤。肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。宫颈癌盆腔淋巴结转移是影响患者预后的重要因素。研究表明，I B-11A期的宫颈癌患者若无盆腔淋巴结转移，其5年生存率可达85 %～90 %，而一旦有区域淋巴结转移，其5年生存率则降为30 %～60 %。即使常规病理检查无淋巴结癌转移等高危因素的患者，仍有10 %的患者出现复发和转移。目前对子宫颈癌复发和转移的诊断技术仍然停留在传统病理组织学水平，但是常规HE染色病理检查对于淋巴结微小的转移病灶(&<2 mm)易于漏诊，并且常规病理组织学无法确定存在于血液中微量肿瘤细胞，而血循环及淋巴系统中微转移病灶的存在，提示肿瘤已不再局限于原发灶，有发展为远处转移的可能。
近年来，随着免疫学及分子生物学的发展，使宫颈癌的微转移检测成为可能[1]。临床上提出了“肿瘤分子分期”的观点，即将分子生物学的理论和技术与肿瘤的临床分期有机地结合起来，来诊断那些常规检查方法不能诊断的存在于全身各系统中的亚临床转移，使肿瘤的分期更加准确，以指导临床治疗方案的确定。宫颈癌微转移检测的价值就在于有助于准确的分期，从而更加有针对性的制定个体化的治疗方案，减少复发和远处转移，改善患者的预后。通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和荧光定量PCR(fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，FQ-PCR)技术检测CK-19和CK-20 mRNA表达来诊断宫颈癌转移成为目前研究热点之一。
1 微转移概述
自1869年Asworth首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们的重视。微转移(micrometastases，MM)又称隐性转移(occult metastasis)，一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶。它可以是单个瘤细胞或独立的瘤细胞灶，无特殊血供，直径小于2 mm，常无任何临床表现，能够逃脱免疫监视、侵犯血管和发展成为肉眼可见的病变。常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查都很难发现。文献中对MM也有下列不同的称谓，如循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、潜伏肿瘤细胞(occult tumor cell，OTC)、微小残存灶(minimal residual disease，MRD)、播散肿瘤细胞(disseminated tumor cell，DTC)、游离肿瘤细胞(isolated tumor cell，ITC)等。在不同的组织中这一概念又有具体的含义，如淋巴结MM指常规组织学水平淋巴结切片未能检出的转移;在血液中，常规方法不能检测出肿瘤细胞，故任何能检出的血循环中的瘤细胞均属MM;骨髓的MM则指在骨髓抽吸和活检标本中检出了瘤细胞，而患者无任何临床上和放射影像上远处或骨髓转移的证据[2]。研究认为，临床转移一般由MM发展而来，但仅少数MM最终能发展为临床转移。MM的瘤细胞灶常以单个细胞或微小细胞团形式存在，通过淋巴系统、血液循环转移至其它组织器官。也可以直接侵袭周围组织或种植于体腔。MM发展成为临床转移至少经过4个阶段：(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离;(2)适应新宿主代谢环境，逃避宿主机体免疫监控;(3)侵袭正常组织，在新宿主组织中存活并增殖;(4)在新宿主中新血管形成，肿瘤生长。MM的转归取决于癌细胞的细胞生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官的微环境。动物实验表明血循环中至少有10 000个肿瘤细胞才可以显性转移，多数发生凋亡，少数进入休眠期，极少数发生增殖。MM灶可长期处于G0期，其增殖与死亡处于平衡状态，只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠中的肿瘤细胞摆脱抑制状态而持续增殖并发展为临床显性转移。
2 MM检测研究现状
2.1 MM检测方法
2.1.1 连续切片 连续切片是最早用于检测淋巴结转移的一种粗略方法，主要是针对手术切除的淋巴结，可使阳性率增加20 %，但缺点是敏感性差且工作量大、粗糙，不适用于血循环、骨髓的MM检测，难以推广。还有应用淋巴结廓清术(clearance technique)(二甲苯-乙醇清除术)和组织培养法、组织微阵列(tissue microarray，TMA)等技术进行MM检测的报道[3]。
2.1.2 免疫学技术 免疫学技术大约有免疫组织化学技术(immunohistochemical technique，IHC)、免疫荧光法(immunofluorescence assay，IFA)、放射免疫导向法(radioimmunoguided surgery，RIGS)、流式细胞分析法(flow cytometry，FCM)，这些都具有重要应用价值，但是由于抗体的标化和选择、单抗的质量、交叉反应、机体产生自身抗体、结果判断缺乏客观统一标准等因素影响其敏感性和特异性。
2.1.3 免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic separation，IMS) IMS是新近建立的方法，用以改进血循环中单个瘤细胞的检测。经此方法得到的细胞再进行mRNA分离。富集的样本可以准备作IHC、FCM、IFA、RT-PCR检测，比传统的采用全血直接用于RT-PCR的方法敏感性提高约10倍，可有效检出107个全细胞中的一个肿瘤细胞。另外，通过IMS分离得到的细胞进行PT-PCR研究，可以有效避免由血液不正常转录而导致的假阳性的产生，提高RT-PCR检测方法的特异性。
2.1.4 分子生物学方法 检测MM的分子生物学方法有核酸杂交法(如Southern、Northern印迹杂交法)、突变等位基因特异性扩增法(mutant allele-specific amplification，MASA)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及近年出现的荧光定量PCR技术(fluorescence quantitative- polymerase chain reaction，FQ-PCR)。PCR技术又称体外基因扩增方法，由美国的Kary Mullis博士在1983年发明，并于1985年公开报道，1993年荣获诺贝尔奖。1991年Smith等首次应用PCR技术检测到血循环中存在转移的肿瘤细胞。之后PCR技术被广泛应用于MM的研究。PCR、RT-PCR检测具有高度敏感性、特异性，可准确检测1 g组织或1 mL液体中的1个癌细胞[4]，被认为是目前检测MM的最有效的方法。RT-PCR具有较高的敏感性和特异性，检测时间相对较短，能在24～48 h内得出结果，同时可检测多个标本;免疫组化法仅能反映标本的局部，而RT-PCR能反映整个标本的情况;RT-PCR操作方法固定，相对易标准化和易控制，人为干扰因素少，且判断结果较形态学方法客观且准确。其缺点是技术要求较高，严格要求新鲜标本及其迅速处理，易受污染。还有PCR结合单链DNA构型多肽分析(PCR-SSCP)、异源双链分析法(HA)、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)、PCR产物的限制性片段长度多肽分析法(PCR-restriction-fragment-length-polymorphism assay，PCR-RFLP)、DNA直接测序技术(DS)。FQ-PCR技术是由美国Applied Biosystems公司在1996年率先研制成功的荧光定量技术。该技术是根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理，设计相应的荧光标记核酸探针，通过PCR反应对相应靶DNA进行均相定性定量测定的技术[5]，具有操作简便、快速、结果判断客观、重复性能好、定量范围宽(可包括0～1 014个拷贝/L)、无需样品梯度稀释、高灵敏性、高特异性、高精确性的特点，采用完全封闭式的操作系统，不需PCR后处理，克服了传统的PCR技术易受污染、造成假阳性等诸多缺点。配以相应的荧光PCR仪，整个PCR过程可实现自动化，且耗时短、操作方便，较之传统的定量方法劳动强度小，易于标准化和推广应用。因此，FQ-PCR技术是基因诊断、疗效评价、技术创新和临床研究的高新技术手段，具有广泛的开发应用前景。
2.2 MM检测的标志物 当今，分子生物学研究发现肿瘤标志物种类众多，MM检测的特异性取决于检测的标志物。标志物主要包括以下几类：(1)特异性基因:包括染色体异常、基因点突变、基因缺失等。正常组织一般不伴有这些改变，检测相关特异性基因可诊断MM，如p53、ras、DCC、erbB-2等。(2)肿瘤特异性标志物:指在肿瘤细胞中存在而在正常细胞中不存在，如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、酪氨酸酶、前列腺特异抗原(PSA)、人乳头瘤病毒(HPV)、易位融合基因EWS-FLI1等。RT-PCR或者FQ-PCR法检测CEA mRNA常用来检测各种消化道肿瘤和乳腺癌的MM。酪氨酸酶是黑色素细胞和黑色素瘤细胞合成黑色素的关键酶，此酶基因转录物的检出可提示转移性黑色素瘤的存在。(3)组织特异性标志物:指在肿瘤起源组织中存在，而在其他组织中不存在，特别是在淋巴细胞和血细胞中不存在，如粘蛋白(mucin)、细胞角化蛋白(cytokeratin，CK)、雌激素受体(ER)及肿瘤抑制基因maspin等。组织特异性标志物及其基因只在特定的组织中表达，如CK仅在上皮组织中表达，正常情况下不存在于间质组织中。如果在间质组织中扩增出CK的表达，则表明有上皮源性肿瘤细胞播散到间质组织中。文献报道，CK19、CK20、多形上皮粘蛋白的核心蛋白(MUC1)这几种标志物都在上皮组织以及上皮来源的肿瘤中高度表达，在正常淋巴结和外周血中均无表达，显示了较好的特异性，因此可作为乳腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌及官颈癌等起源于上皮组织肿瘤的组织特异性标志物[5]。(4)转移特异性基因。(5)肿瘤伴随的病毒。利用任何一种标志物虽然都可能建立一种检测MM的方法，但理想的标志物应同时具备敏感性和特异性。
3 宫颈癌MM的研究
MM的检测在多种肿瘤的研究中显示出较好的临床应用价值。在乳腺癌、肺癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等实体瘤的研究中，人们已发现MM的阳性检出率与患者的预后有密切关系，并可早期诊断肿瘤的复发和远处转移[6]。研究表明由于90 %以上的宫颈癌患者可检测到人乳头瘤病毒(HPV) DNA，HPV DNA的E6/E7基因整合到宿主基因并稳定表达与宫颈癌发生、发展关系密切，因此对宫颈癌MM的研究，多年来人们主要将焦点放在盆腔淋巴结及外周血中HPV基因的检测上。
研究报道宫颈癌淋巴结HPV检出率为14 %～71 %，宫颈鳞癌转移灶HPV16的阳性率为71 %(5/7)。Burnett采用PCR技术检测了21例IB期宫颈癌患者盆腔淋巴结HPV的表达，常规组织病理学证实阴性的74个淋巴结中，复发患者的HPV DNA检出率71 %，显著高于未复发患者35 %，提示该指标是复发的高危因素。Ikenberg等[7]检测了21例IB～IIB期HPV16阳性宫颈癌患者的淋巴结，常规病理组织学证实淋巴结均无癌转移，随访后发现淋巴结显示HPV强阳性的12例患者中，8例患者于3年内死亡，而无HPV强阳性的患者均长期存活。从而提示HPV DNA有助于早期判断高危患者，指导术后辅助治疗。但也有不同的研究结果报道，Czegledy等[8]检测了31例宫颈癌患者的157枚淋巴结HPV16 DNA的表达，阳性率为71 %(22/31)，其中复发组的检出率为75 %(6/8)，而无复发组为70 %(16/23)，研究者认为HPV16 DNA的表达尚不能用于判断预后。
研究报道宫颈癌外周血HPV的检出率为20.0 %～92.3 %。Liu等[9]检测了60例宫颈癌患者治疗前的外周血HPV DNA，阳性率为20 %(12/60)。Pao等[10]应用巢式RT-PCR技术检测15例Ⅳ期宫颈癌患者外周血的MM，结果显示15例患者的癌组织中HPV16阳性率为86.7 %(13/15)，这13例癌组织HPV16阳性患者外周血的HPV16检出率为92.3 %(12/13)，而HPV阴性患者和正常对照组均未检测到HPV16，从而提示宫颈癌患者外周血中HPV16 mRNA的存在可作为循环肿瘤细胞的一个敏感指标。Tseng等[11]检测了35例局部晚期宫颈癌患者的外周血HPV16、HPV18 mRNA的表达，阳性率为51.4 %(18/35)，随访22个月，18例阳性者中10例复发，而17例阴性者中仅3例复发，结果提示外周血HPV E6可用于预测远处转移。但由于并非所有的宫颈癌患者均有HPV16、HPV18感染，而且其他肿瘤如鼻咽癌、乳腺癌也发现与HPV感染有关，因此将HPV作为MM的检测尚有一定的局限性。
近年来研究者开始将目光转向了组织特异性标志物。Czegledy等[12]报道宫颈癌淋巴结CK mRNA的阳性率为27.5 %(16/69)。Van Trappen等[13]采用实时定量RT-PCR技术检测了宫颈癌患者的CK19 mRNA的表达。研究发现常规组织病理方法显示无癌转移的淋巴结中44 %(66/150)检测到了CK19表达，而良性病变对照组32枚淋巴结中只有1枚呈现CK19低水平表达。研究提示早期宫颈癌中约有50 %盆腔淋巴结存在MM，远高于常规病理诊断阳性率16 %～33 %。Juretzka等[14]采用免疫组化法检测了49例IA2～IB2宫颈癌患者的976枚盆腔淋巴结标本，这些患者的淋巴结经常规病理检测均为阴性，研究结果显示8.1 %(4/49)的淋巴结病理阴性患者免疫组化法显示有MM，淋巴结阳性率为0.41 %(4/976)。随访结果显示50 %MM的患者出现复发，而无MM的患者中复发率为6.7 %。Yuan等[15]则采用RT-PCR技术检测了84例I B～II B期宫颈癌患者的外周血中的MM，在排除假基因的干扰后，分析结果显示21.4 %的患者外周血中CK19 mRNA呈现阳性，而良性病变患者的阳性率为5.7 %，正常对照者为0。但分析结果并未显示检出率与分期、盆腔淋巴结转移等预后因子之间的相关性。陈雅卿等[16]采用RT-PCR法术前检测250例Ⅰ A～Ⅱ A期宫颈癌患者和50例妇科良性肿瘤患者及18名健康自愿者外周血中CK19、CK20 mRNA的表达，250例早期宫颈癌患者外周血中CK19、CK20 mRNA的阳性表达率分别为36 %和24 %，而在妇科良性肿瘤中分别为3.0 %和0 %，18例健康自愿者无1例表达CK19、CK20 mRNA阳性;CK19、CK20 mRNA的单独阳性表达率除与脉管瘤栓显著相关外，与宫颈癌的预后因素如分期、分化、组织类型、淋巴结转移、肿瘤大小均无关，而CK19、CK20 mRNA双阳性表达与淋巴结转移和脉管浸润及近期盆腔外的转移显著相关，表明外周血中CK19、CK20 mRNA的表达可以作为检测早期宫颈癌MM的生物学指标，但对预后的意义有待于进一步研究。程玺等[17]采用RT-PCR技术检测Ⅰ～Ⅱ期宫颈癌患者盆腔淋巴结CK19 mRNA的转录，对32例宫颈癌患者共检测淋巴结标本206枚，经常规病理组织学方法检测到24枚淋巴结有癌转移，阳性率为12 %(24/206);经RT-PCR法检测到44枚淋巴结表达CK19 mRNA，检出率为21 %(44/206)，RT—PCR法与常规病理组织学方法比较，差异有统计学意义。常规HE染色阴性的182枚淋巴结中，29枚检测到CK19 mRNA的特异性条带，MM的检出率为15.9 %(29/182);低分化患者的淋巴结CK19检出率为87.5 %(7/8)显著高于中、高分化患者的检出率33.3 %(8/24);而淋巴结CK19的检出率与年龄、临床分期、组织学类型、宫颈肿瘤大小、肌层浸润深度、宫旁浸润、脉管癌栓均无明显关系。淋巴结CK19 mRNA阳性患者的4年无瘤生存率为58 %;而淋巴结CK19 mRNA阴性患者的4年无瘤生存率为76.5 %，差异无统计学意义。与传统的病理组织学比较，采用RT-PCR技术检测CK19 mRNA转录能显著提高淋巴结MM的检出率，预后判断有待增大病例数进一步研究。
Wang等[18]利用RT-PCR和IHC检测早期宫颈癌前哨淋巴结(SLN)的MM比常规的病理学方法敏感，RT-PCR检测CK19的阳性率是42.85 %，IHC检测是20 %，RT-PCR检测早期宫颈癌前哨淋巴结(SLN)比IHC敏感，因此SLN分子评价是补充常规组织学检查一个有价值的工具。Bats等[19]认为前哨淋巴结(SLN)活检可以提高早期宫颈癌的分期，但需大量人口研究来评价SLN活检的临床意义。
也有研究者以鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCAg)为标志物检测宫颈癌患者外周血。Duk等[20]采用酶联免疫检测法的研究结果显示，患者的血清SCCAg阳性率为55.7 %(295/529)，多因素分析结果显示，SCCAg可作为宫颈癌的独立预后指标。Stenman等[21]采用RT-PCT技术检测15例患者的外周血SCCAg的阳性率为40 %(6/15)，随访2年，6例SCCAg阳性者中3例复发，而9例阴性者1例复发，1例病情进展，结果显示该指标有助于宫颈癌的分期和预后判断。
4 结语
宫颈癌治疗失败往往与一些临床病理因素有关，其中淋巴结转移被公认为是影响预后的重要因素。但我们对淋巴结转移的诊断技术仍然停留在传统的病理组织学水平，如果能够尽早地诊断淋巴结和脉管中的MM，就能够更有针对性地制定个体化的术后辅助治疗，减少复发和转移，提高患者的生存率和生活质量。基因标志物的选择是MM得以准确检出的关键。细胞角蛋白家族中的CK20和CK19作为上皮组织来源的组织特异性标志，是文献报道中检测MM应用最多的基因标志。但研究报道结果不同，甚至相反，这是由于CK19基因表达时存在假基因的干扰。进行引物重新设计和检测后，解决了假基因干扰这一研究中的关键问题。
由于肿瘤转移过程机制复杂，影响因素众多，不少地方尚存在争议，MM的临床意义也有待进一步研究，检测的方法有待统一，检测结果有待标准化。MM的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境，即MM不是必然发生肿瘤的复发和转移，但它提示发生复发和转移的可能性大。普通PCR技术本身存在一定的缺点，如：(1)因未直接见到癌细胞，既使存在突变型基因或基因产物，也不一定存在活的肿瘤细胞;(2)PCR技术极为敏感，需要有经验的技术操作;(3)污染基因物质可产生假阳性结果;(4)扩增mRNA常需新鲜标本，库存的石蜡包埋块有时不适用于RT-PCR测定;(5)激素干扰可下调标记基因的表达，因之产生假阴性结果。另外，PCR检测费用昂贵，限制了其广泛的临床研究，对早期的诊断意义也不大。肿瘤的复发、转移是多阶段过程，故肿瘤MM的确切意义和临床价值尚待进一步商讨，与预后的确切关系有待进一步观察。宫颈癌MM的检测有待于大规模的前瞻性随机研究证实。这些都是宫颈癌MM检测有待解决的问题。相信随着分子生物学技术的不断发展以及对宫颈癌癌基因和肿瘤相关抗原研究的深入，对MM检测的不断认识和研究，将建立更科学的检测方法，揭示MM的机制，会逐步确定CK20、CK19在宫颈癌中的临床应用价值，明确MM与临床转移、复发、生存期的关系，为临床恶性肿瘤的病情判断、治疗以及预后评估提供更好的依据。
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