作者：曹虹然 孙乔 刘德赢 白雪峰 岳秀兰
【摘要】 目的：探讨结直肠癌c-erbB-2癌基因扩增的临床意义。方法：应用差别PCR技术检测52例结直肠癌患者在c-erbB-2癌基因的扩增情况。结果：48.1%（25/52）的结直肠癌发现有c-erbB-2癌基因的扩增；有淋巴结转移及Dukes分期C+D期患者c-erbB-2基因扩增率（72.0%及68.0%）分别高于无淋巴结转移及Dukes分期A+B期患者（25.9%及29.6%）；c-erbB-2基因扩增与肿瘤组织学分化和组织病理类型显著相关；伴有腺瘤性息肉的结直肠癌患者c-erbB-2基因扩增率高于不伴有腺瘤性息肉的结直肠癌患者（100.0%对43.5%，P&<0.05）。结论：差别PCR技术检测c-erbB-2癌基因的扩增是一种快速简便、灵敏可靠的方法；c-erbB-2癌基因的扩增在一定程度上反映结直肠癌的分化状态和生物学行为，对结直肠癌的预后和转移潜力是一种良好的判断指标，并可指导临床治疗。
【关键词】 结直肠癌；c-erbB-2；差别PCR；癌基因扩增
Abstract Objective:To explore the clinical significance of c-erbB-2 oncogene ampilification in colorectal cancer（CRC）. Methods: C-erbB-2 oncogene ampilification was examined by differential polymerase chain reaction (dPCR) in 52 cases of colorectal cancer. Results: C-erbB-2 oncogene ampilification was found in 48.1%(25/52)of colorectal cancer. The ampilification incidence of c-erbB-2 in patients with lymph node metastasis and in Dukes'stage C+D (72% and 68%) was higher than that in patients without lymph node metastasis and in Dukes'stage A+B (25.9% and 29.5%)，respectively(both，P&<0.01). Amplification of c-erbB-2 gene was correclated significantly with histological grade(P&<0.01) and histopathological phentypes(P&<0.05). Occurrence rate of c-erbB-2 oncogene amplification in the patients of colorectal cancer with adenomatous polyp was higher than that in those without adenomatous polyp(100% vs 43.5%， P&<0.05).Conclusion: dPCR is a quick， simple， sensitive and reliable method to detect c-erbB-2 0ncogene amplification. To some extent， the amplification of c-erbB-2 oncogene represents the differentiation and biological behavior of colorectal cancer， thus can be taken as an independent prognostic marker for predicting the prognosis and metastatic potantial of colorectal cancer can be used to guide the clinical treatment of the disease.
Key words Colorectal cancer; c-erbB-2; Differential polymerase chain reaction; Oncogene amplification
结直肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等经济发达地区和国家十分常见，一般为第2～4位常见癌症。随着我国经济快速发展，生活方式发生改变，结直肠癌的发病率和死亡率在我国经济发展较快的城市和地区迅速上升。结直肠癌相关基因的深入研究和基因检测技术的发展对于筛查结直肠癌高危人群，判断结直肠癌的生物学行为、预后及指导治疗具有重要意义[1]。c-erbB-2癌基因的扩增和过度表达见于人类多种肿瘤，与细胞恶变、肿瘤分化、肿瘤转移和生存期相关，具有预后价值[2]。因此，c-erbB-2作为判断预后的分子标记及作为基因治疗的靶基因受到普遍关注。对于c-erbB-2癌基因在结直肠癌中的扩增频率及其临床意义，国内外研究较少，并存在争议[3]。本文采用快速、简便、无放射性污染的差别PCR（differential PCR，dPCR）技术检测52例结直肠癌中c-erbB-2癌基因的扩增情况，探讨c-erbB-2基因扩增的临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料 52例结直肠癌新鲜组织标本，其中结肠癌19例，直肠癌33例，取自在辽宁省肿瘤医院及包头市肿瘤医院住院手术的患者，均经病理确诊为结直肠癌，其中男27例，女25例，年龄28～78岁，平均年龄56.3岁。取其中20例自身正常肠粘膜(距肿瘤边缘大于5cm处)作对照。标本立即剔除血块及脂肪组织，置于液氮保存备用。
1.2 DNA提取 采用上海生工生物工程公司生产的SK341临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒提取组织中DNA，具体操作步骤如下：（1）5～30mg组织样品用手术刀切成小块，在液氮中碾碎。（2）将粉末收集到1.5mL离心管中，用200μL TE悬浮。（3）在按样品制备方法制备的200μL样品中，加入400μL Digestion Solution，混匀;加入3μL Proteinase K，混匀，55℃保温3小时。（4）加入200μL无水乙醇，混匀，然后用1mL Tip头将样品全部转移到套放于2mL 收集管内的UNIQ-10柱。（5）用台式离心机，8 000转/分，室温离心1分钟。（6）取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回收集管中，加入500μL Wash Solution，10 000转/分，室温离心30秒。（7）重复步骤（4）一次。（8）取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液。将柱子放回收集管中，10 000转/分，室温离心15秒，以除去残留的Wash Solution。（9）将柱子放入新的无菌的1.5mL离心管中，在柱子中央加入50μL Elution Buffer，室温放置２分钟。（10）10 000转/分，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。样品可以4℃或-20℃保存。
1.3 引物合成 用于差别PCR扩增的两对引物由上海生工生物工程公司合成。第一对引物用于特异性地扩增c-erbB-2基因序列第2122～2219位的98个碱基[4]，引物序列为：上游引物：5′-CCTCTGACGTCCATCATCTC-3′，下游引物：5′-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3′。第二对引物用于特异性地扩增单拷贝β-肌动蛋白（β-actin）基因序列第405～722位的318个碱基，引物序列为：上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。
1.4 差别PCR检测 每一反应管总体积25μL，加入10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 3μL ，2mM dNTP 4μL，Taq DNA聚合酶2U，c-erbB-2及β-actin上下游引物终浓度各为0.33μM，DNA样本0.1μg。双蒸水补足反应体积（采用的SK491 DNA多聚酶链式反应试剂盒由上海生工生物工程公司生产）。其中以β-actin作为内参对照，在同一反应体系进行c-erbB-2和β-actin基因的扩增。反应条件为预变性：95℃，2分钟；变性：94℃，1分钟；退火：55℃，1分钟；延伸：72℃，50秒，共35个循环。末轮循环72℃延伸5分钟。取PCR反应产物15μL在含0.5μg/mL溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶中电泳，电压为100V，电势梯度8V/cm，约25分钟。紫外灯下观察，摄片。
1.5 光密度扫描分析 电泳结果应用凝胶成像仪（美国Cold Spring公司生产）扫描记录，Gel-pro analyzer 3.1凝胶分析软件(Media Cybernetics公司产品)测定各区带光密度值(IOD值)。c-erbB-2基因相对拷贝数由c-erbB-2电泳带光密度值/β-actin电泳带光密度值确定。该比值×318/98为校正拷贝数。这是由于β-actin扩增片段为318bp而c-erbB-2扩增片段为98bp，β-actin吸附的溴化乙锭较多，光密度值较大，故需要校正。
1.6 统计分析 统计学处理采用卡方检验，应用SPSS 10.0统计软件分析实验数据。
2 结果
2.1 c-erbB-2癌基因在结直肠癌中的扩增 以20例结直肠癌患者自身正常癌旁组织粘膜为对照，校正后，c-erbB-2 /β-actin电泳带光密度比值为1.01±0.20，单侧99%正常值范围上限为1.46，凡c-erbB-2基因校正相对拷贝值&>1.46即为扩增。见图1。
C1～C4为结直肠癌标本，N1～N4为癌旁正常对照，M为DNA标志（marker）。其中C1和C3存在c-erbB-2基因扩增，C2和C4未扩增。
图1 结直肠癌组织中c-erbB-2基因
差别PCR检测结果分析
2.2 c-erbB-2基因扩增与结直肠癌临床病理的关系 52例结直肠癌中，25例存在c-erbB-2癌基因的扩增，占48.1%（25/52）。c-erbB-2癌基因扩增与Dukes分期、淋巴结转移、肿瘤组织学分化和组织病理类型相关，并且常见于伴有腺瘤性息肉的结直肠癌，而与年龄、性别、肿瘤占肠周比例、大体分型和浸润深度无关，见表1。
3 讨论
c-erbB-2癌基因（又称neu/HER-2基因）是Shih等首次通过NIH/3T3细胞转染试验，在乙基亚硝脲诱导的大鼠神经胶质纤维瘤中分离鉴定出了一种转化基因，称为neu基因。Padhy等进一步证实neu基因与编码表皮生长因子受体（EGFR）基因一样与病毒癌基因 V-erbB具有同源序列，因此将EGFR基因命名表1 c-erbB-2基因扩增与结直肠癌临床病理的关系为c-erbB-1而将neu癌基因命名为c-erbB-2。c-erbB-2基因定位于第17号染色体的 q11.2-12上，编码185KD具有酪氨酸激酶活性的跨膜磷酸糖蛋白。其蛋白氨基酸结构与EGFR有惊人的相似性，似乎表明c-erbB-2受体的生物学行为类似于EGFR，在控制细胞分裂和分化中起重要作用。小鼠肿瘤形成时，c-erbB-2基因主要通过其蛋白跨膜部分的点突变而被激活，而在人类c-erbB-2原癌基因的活化主要表现为基因扩增或其扩增产物的过度表达[5]。
研究表明c-erbB-2基因及其编码的蛋白在许多肿瘤细胞中，如乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌以及卵巢和宫颈癌均可出现高度扩增和表达[6]，并与肿瘤的复发、进展、转移及预后因素相关。c-erbB-2基因在结直肠癌中的扩增及其临床意义国内外研究的较少，并存在争议，值得进一步研究。西班牙学者Golijow[2]对54例结直肠癌标本应用差别PCR方法检测到1例扩增，扩增率仅为1.85%；而国内骆成玉等[3]应用同样方法检测c-erbB-2癌基因在36例结直肠癌中的扩增率高达91.7%（33/36），并与肿瘤分化和转移相关（P&<0.05）。为了进一步探讨和明确c-erbB-2基因扩增与结直肠癌临床病理参数的关系，本实验对52例结直肠癌标本进行差别PCR检测，以其中20例自身正常癌旁组织粘膜为对照，发现48.1%（25/52）的病例有c-erbB-2基因的扩增，扩增率与王亚平报道的30.4%（7/23）接近。之所以与Golijow报道的1.85%有较大的差异可能是因为中国与西班牙患者结直肠癌发病所涉及的基因及分子机制不同，而与骆成玉报道的扩增率为91.7%的差别尚不能解释。本研究发现Dukes分期C+D期患者c-erbB-2基因扩增率（68%）高于Dukes分期A+B期患者（29.5%）（P&<0.01）暗示c-erbB-2基因扩增可反映结直肠癌病程进展。伴有淋巴结转移的结直肠癌扩增率高，表明c-erbB-2可能参与结直肠癌的转移机制，提示c-erbB-2基因的扩增有更强的侵袭和转移能力。近年研究揭示，c-erbB-2蛋白产物p185定位于细胞微绒毛及伪足，能加速细胞运动，因而推测c-erbB-2基因参与细胞浸润和转移的调节[7]。中低分化c-erbB-2基因的扩增率高于高分化（P&<0.01）以及粘液腺癌、印戒细胞癌扩增率高于管状腺癌（P&<0.05）。上述均表明c-erbB-2基因的扩增在一定程度上反映结直肠癌恶性生物学行为和不良的预后，临床上可作为独立的预后指标。另外，还发现伴有腺瘤性息肉的结直肠癌c-erbB-2基因扩增率高于不伴有腺瘤性息肉的（P&<0.05），这以前未见报道。c-erbB-2基因的扩增及其蛋白过度表达与肿瘤的发生、发展、转移中的作用，使其成为肿瘤基因治疗的合适靶子[8]。目前肿瘤基因治疗计划通过反义核苷酸技术或特异性核酶干扰癌基因的转录和翻译，从而关闭其表达。美国RAC(肿瘤中心)以“一个病人使用(single-patient use)”作为基因治疗采纳与否的指导思想。这样在分子水平上对c-erbB-2基因做出个体扩增情况的分析用来指导临床治疗显得尤其重要。而要施用一种针对c-erbB-2癌蛋白的单克隆抗体类药物（Herceptin）治疗，还需检测c-erbB-2癌蛋白是否过度表达。
差别PCR是一种用于检测基因拷贝数变化的半定量PCR技术。β-actin作为管家基因在细胞中恒定表达，可作为良好的内参对照。将目的基因c-erbB-2同内参对照β-actin置于同一体系共扩增，消除了试管间差异，保证同批及不同批样品具有可比性，结果可靠稳定。与Southern blot和免疫组化技术相比具有无须较多新鲜组织，DNA用量极少，对DNA质量和纯度要求不高，扩增特异、准确、重复性好，结果直观，无杂交及免疫组化背景干扰，快速简便，灵敏可靠，无放射性污染等优点，非常适合临床应用。
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