关于重组人B7 H1IgV疫苗对小鼠骨髓瘤细胞的抑制作用

代写论文网： 【摘要】 目的：探讨重组人B7H1IgV融合蛋白对小鼠骨髓瘤的预防和治疗效果及其对荷瘤小鼠外周血中CD4+CD25+ T细胞水平的影响. 方法：用重组人B7H1IgV融合蛋白免疫小鼠，待抗体产生后接种SP2/0肿瘤细胞作为预防组；用重组人B7H1IgV融合蛋白免疫小鼠，同时接种SP2/0肿瘤细胞作为治疗组. 监测小鼠体质量、肿瘤体积的变化及生存期；检测小鼠体内CD4+CD25+ T细胞水平. 结果：重组人B7H1IgV融合蛋白在预防组和治疗组中均显示出了较好的抑瘤作用，并可显著降低治疗组小鼠体内CD4+CD25+ T细胞水平. 结论：重组人B7H1IgV融合蛋白能够引起小鼠的体液免疫，并抑制SP2/0肿瘤细胞的生长，从而延长荷瘤小鼠的生存期. rhB7H1IgV融合蛋白肿瘤疫苗有望成为一种肿瘤免疫治疗的候选者.
【关键词】 疫苗 小鼠 基因重组
　　0 引言
　　B7H1（B7homologue 1）是共刺激分子B7家族成员之一，2004年被命名为CD274. 它在多种肿瘤细胞表面高表达，在肿瘤免疫逃逸过程中可能起到重要作用. 研究［1］发现，B7H1可能通过其IgV区与CTL细胞表面PD1相结合，从而引发效应性T细胞的凋亡. 我们已经证实rhB7H1IgV蛋白能够有效诱导出针对B7H1的特异性中和抗体，且该抗体不仅可以与人肿瘤细胞表面的B7H1相结合，还可与小鼠SP2/0肿瘤细胞表面的B7H1相结合［2］. 在此基础上，我们进一步研究了rhB7H1IgV蛋白免疫小鼠对SP2/0荷瘤小鼠的预防和治疗性作用，及其对荷瘤小鼠外周血中CD4+CD25+ T细胞水平的影响.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 rhB7H1IgV菌种由我室保存；5 wk龄雄性BALB/c小鼠50只，体质量21～25 g(上海国家啮齿类实验动物种子中心)；小鼠SP2/0细胞（小鼠骨髓瘤细胞）由本室保存；B7H1/Fc蛋白和抗B7H1mAb(R&&D公司)；羊抗小鼠IgGHRP(华美生物工程公司)；蛋白Marker（Pharmacia公司）；FITC标记大鼠抗小鼠CD25，PE标记大鼠抗小鼠CD4，分型均为IgG（Biolegend公司），同型对照使用FITC和PE标记的大鼠IgG（Southern Biotech公司）；Ni亲和柱（Qiagen公司）；常压液相色谱仪（瑞典Pharmacia公司）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；550型ELISA读数仪（美国BioRad公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 rhB7H1IgV融合蛋白的纯化和复性 取含pQE30TTB7H1IgV重组质粒的菌株，大量诱导菌液，5000 r/min离心10 min，收菌，超声裂菌；4℃，2500 g离心20 min，分别收集上清液和沉淀. 将沉淀用6 mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解. 将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDSPAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析. 在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用NiNTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀（包涵体）. 按1 g菌体加10 mL裂菌缓冲液0.1 moL/L NaCl，0.05 moL/L Tris，（pH 8.0）的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌. 2500 g，离心15 min，弃上清，在1 g沉淀中加10 mL包涵体溶解液（ 6 moL/L尿素，0.1 moL/L Nah3PO4， 0.01 moL/L Tris，pH 8.0). 4℃搅拌2 h，2500 g离心15 min，共2次，收集上清待用. 用平衡液（6 moL/L尿素，0.1 moL/L Nah3PO4， 0.01 moL/L Tris，pH 8.0)充分洗涤Ni柱，先用含0.01 moL/L咪唑的平衡液洗脱杂蛋白，再用含0.250 moL/L咪唑的平衡液洗脱目的蛋白. 收集洗脱峰，纯化产物透析至2 moL/L尿素，0.1 moL/L Nah3PO4， 0.01 moL/L Tris (pH 8.0)复性，终浓度1 g/L. 最后透析入0.01 moL/L Tris(pH 9.5)中，PEG 8000浓缩后用Bradford法测定蛋白浓度.
　　1.2.2 预防组小鼠的免疫 将BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只. 持续免疫组：隔周免疫，前3次于背部皮下多点注射，第4次腹腔注射，每次40 μg rhB7H1IgV+200 μL生理盐水，以后隔周进行腹腔注射；常规免疫组：隔周免疫，前3次于背部皮下多点注射，第4次腹腔注射，每次40 μg rhB7H1IgV+200 μL生理盐水；空白对照组：仅用生理盐水进行常规免疫. 最后1次常规免疫完毕后14 d，取对数生长期状态的SP2/0肿瘤细胞，按1×107/只接种至小鼠背部皮下. 每周观察小鼠体内抗体滴度变化，待观察到形成肿瘤组织块后隔日检测肿瘤体积和小鼠体质量. 在小鼠死亡时取出肿瘤组织称质量，统计小鼠生存期.
　　1.2.3 血清抗B7H1抗体效价测定 分别于第4次免疫后10 d以及接种肿瘤细胞后每周取血，收集抗血清，通过ELISA检测抗B7H1抗体效价：将B7H1/Fc溶液包被96孔板，用不同稀释度的抗B7H1mAb和免疫获得的抗血清与其结合，加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗， OPD（邻苯二胺）显色，测A490 nm值.
　　1.2.4 治疗组小鼠的免疫 将BALB/c小鼠随机分为4组. 治疗组：5只，按1×107/只将SP2/0细胞接种至小鼠背部皮下，同时每周免疫，共3次，每次40 μg rhB7H1IgV， 溶于200 μL生理盐水；肿瘤组：7只，按照上述剂量只接种肿瘤细胞；对照组：10只，正常对照小鼠；免疫组：10只，按照上述剂量只进行免疫. 接种肿瘤细胞1 wk后开始检测肿瘤组织体积. 免疫结束后取小鼠外周血，检测外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+ T细胞的百分比变化情况.
　　1.2.5 外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例检测 取100 μL EDTA抗凝的人外周血加入5 mL流式管底，分别取10 μL标记抗CD4和CD25抗体加入流式管底与全血混匀，室温避光孵育20 min，同型对照使用FITC和PE标记的大鼠IgG；加入2 mL红细胞裂解液混匀后避光放置10 min，溶解红细胞；1000 r/min离心5 min后弃上清；加入0.5 mL PBS洗液重悬细胞，待流式细胞仪检测.
　　统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS软件进行统计分析，数据处理采用t检验，生存期采用Logrank检验，P&<0.05为有统计学差异. 2 结果
　　2.1 预防组小鼠的抑瘤效果及生存期 于第4次免疫后10 d采血，取血清，检测抗B7H1抗体滴度. 持续免疫组和常规免疫组抗血清中抗B7H1抗体滴度均升高，达到1∶［（8.4±4.4）×104］. 接种肿瘤细胞后每周检测抗体滴度，持续免疫组抗B7H1抗体滴度一直维持在1×104以上，常规免疫组抗B7H1抗体滴度在最后一次免疫后3 wk逐渐下降. 接种肿瘤细胞9 d后肿瘤组织生长至可检测水平（图1）. 对照组成瘤率最高，持续免疫组成瘤率最低；对照组死亡率最高，持续免疫组和常规免疫组死亡率较低. 荷瘤小鼠死亡时间的统计显示：对照组在接种肿瘤细胞后38～58 d全部死亡，而持续免疫组和常规免疫组的死亡时间推后，分别为42～72 d和64～78 d. 经Logrank统计学分析，两组的生存期与对照组相比有统计学差异（P&<0.05，图2）.
　　2.2 治疗组小鼠的抑瘤效果 在接种肿瘤细胞后16 d后，治疗组的肿瘤体积较肿瘤组显著减小（图3）. 经统计学分析瘤质量，抑瘤率达28.1%.
　　 2.3 治疗组小鼠外周血CD4+CD25+ T细胞变化 流式细胞术检测表明，免疫组小鼠的CD4+CD25+ T细胞占外周血中CD4+T细胞的（10.4±1.1）%，正常组为（9.5±2.1）%，肿瘤组为（40.9±8.2）%，治疗组为（25.0±5.4）%. 与肿瘤组比较，治疗组的外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例显著下降(P&<0.05).
　　3 讨论
　　研究表明，B7H1可能与肿瘤免疫逃逸、炎症、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等发病机制和治疗有关. 使用抗B7H1mAb可有效抑制表达B7H1的肿瘤细胞在荷瘤小鼠体内的生长已在多项实验中得到了验证. 其中，Thompson等 ［3］使用单克隆抗体阻断B7H1，同时联合传统免疫疗法治疗肾细胞癌荷瘤小鼠，结果显示仅使用传统免疫疗法治疗的小鼠肿瘤体积变化不大，而经抗B7H1mAb联合传统化疗方法治疗的小鼠肿瘤组织逐渐消退. 另有研究［4］将B7H1阻断性抗体与活化T淋巴细胞一同灌注入表达有B7H1的鼠鳞状细胞癌的动物体内，治愈率达到60%. 这些结果均指出在荷瘤小鼠体内维持一定浓度的抗B7H1抗体对抑制表达B7H1肿瘤细胞的生长和促使肿瘤消退都具有十分重要的意义. CD4+CD25+ T细胞能够促使肿瘤细胞发生免疫逃逸. 实验证实卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和结肠癌等多种肿瘤患者的外周血和肿瘤局部的CD4+CD25+ T细胞升高［5-6］.因此，去除CD4+CD25+T细胞可能诱导并提高抗肿瘤免疫反应.
　　rhB7H1IgV肿瘤疫苗免疫的荷瘤小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长受到抑制，生存期延长的原因可能有以下几点：首先，使用rhB7H1IgV疫苗免疫产生了抗B7H1抗体，该抗体可能阻断了肿瘤细胞表面B7H1与效应性T细胞表面PD1间的相互作用，从而减少效应性T细胞的凋亡；该抗体还可能通过与肿瘤细胞表面B7H1相结合引发CDC作用杀伤肿瘤细胞［2］. 其次，在淋巴器官内，抗原呈递细胞表面的B7H1与致敏T淋巴细胞相互作用诱导致敏T淋巴细胞的无能［7］. 在我们的实验中，抗rhB7H1IgV多克隆抗体可能阻断了这种相互作用，从而诱导出更强的针对肿瘤细胞表面特异性抗原的细胞免疫反应. 我们的检测结果还表明，该疫苗能够降低外周血CD4+CD25+T细胞水平，可能诱导了肿瘤免疫.
　　综上所述，这种rhB7H1IgV肿瘤疫苗，有望成为B7H1+肿瘤免疫治疗的候选者之一. 同时，还由于其可与小鼠SP2/0细胞相结合，为我们今后进行深入的动物实验研究奠定了基础.

【参考文献】
［1］ Wang SD， Bajorath J， Flies DB， et al. Molecular modeling andfunctional mapping of B7HI and 137DC uncouple costimulatoryfunctionfrom PDl interaction［J］. J Exp Med， 2003， 197(9):1083-1091.

［2］ 王伟华，张英起，颜 真，等. 重组B7HIIgV融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定［J］. 中国生物制品学杂志， 2007，20(1):9-14.

［3］ Thompson RH， Webster WS， Cheville JC，et al. B7H1 glycoprotein blockade: A novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma［J］. Urology， 2005， 66(5 Suppl): 4-10.

［4］ Strome SE， Dong H， Tamura H，et al. B7H1 blockade augments adoptive Tcell immunotherapy for squamous cell carcinomal［J］. Cancer Res， 2003， 63(19): 6501-6505.

［5］ Wickelgren I. Policing the immnune system［J］. Science， 2004， 306(5696): 596-599.

［6］ Wolf AM， Wolf D， Steurer M， et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2003， 9(2): 606-612.