关于钙离子在P物质促胃癌细胞增殖过程中的作用

【摘要】 目的: 研究P物质（SP）对体外培养的人低分化胃癌细胞系MKN45增殖的调节作用，探讨钙信号在其中的作用. 方法: 以第4代人胃癌细胞系MKN45为研究对象，用MTT方法观察了不同浓度的SP，ASN1377642（NK1受体拮抗剂）、新霉素（PIP2拮抗剂）、尼卡地平(钙通道阻断剂）对MKN45增殖的影响. 结果: 对于体外培养的人低分化胃癌细胞系，不同浓度的SP(10， 50， 100 nmol/L)可以显著的刺激MKN45的增殖，其增殖率分别为57.23%，63.75%，52.95%（P&<0.05）. 不同浓度的ASN1377642、尼卡地平和新霉素与MKN45预先孵育后SP促MKN45的增殖率显著降低（P&<0.05）， 但是增加上述药物剂量其抑制效应并无显著增加（P&>0.05）. 结论: SP可通过与NK1结合有效促进胃癌细胞增殖. ASN1377642， 尼卡地平和新霉素可以显著的抑制SP的促增殖效应，Ca2+可能在该过程中起重要作用.
【关键词】 P物质 胃肿瘤细胞 增殖
　　0 引言
　　感觉神经肽P物质（substance P， SP）是主要的速激肽之一，广泛分布于包括神经系统在内的各组织中，SP除具有神经递质和炎性介质的作用外，对多种细胞还具有促有丝分裂活性. 研究［1-2］表明SP对多种细胞有促有丝分裂活性，促进细胞的增殖，其中包括平滑肌细胞、上皮细胞以及一些神经源性的肿瘤细胞等. SP通常是与G蛋白结合型受体结合后发挥生物学作用的，其中NK1受体是最重要的受体亚型，SP与NK1受体结合可激活细胞肌醇磷脂的水解、细胞内Ca2+升高、cAMP水平增高以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）［3-4］，从而启动细胞内一系列信号事件，激动相应的第二信使而启动多个代谢途径. 然而SP与胃癌细胞增殖的确切关系目前尚未阐明. 本研究旨在观察SP对体外培养的人胃癌细胞是否有促增殖作用以及钙信号在其中的作用. 为胃癌的临床综合治疗提供新的实验和理论基础.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 人胃低分化腺癌细胞系MKN45（第四军医大学实验动物中心）；SP（瑞士ALEXIS公司）；ASN1377642（德国Merck公司）；尼卡地平和新霉素（第四军医大学药理学教研室）；噻唑蓝(MTT)（美国Sigma公司）； 小牛血清（Sigma）；RPMI1640培养基（Gibco公司）； CO2孵箱(日本池本理化工业株式会社)，酶联检测仪(美国BioRad550型).
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养 将人胃癌MKN45细胞培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，添加青霉素及链霉素等. 于37℃，50 mL/L CO2的条件下常规培养. 取指数生长期2×107/L细胞传代及接种于96孔板中，同时加入处理药物，培养48 h.
　　1.2.2 实验处理及分组 将2×107/L细胞接种于96孔板，每组8个复孔. 实验组分组如下：①分别以10，50， 100 nmol/L SP与MKN45细胞供孵育48 h；②分别以50，250，500 nmol/L ASN1377642预先与MKN45细胞供孵育1 h，然后加入10 nmol/L SP孵育48 h；③分别以1×10-7，1×10-6，1×10-5 mol/L尼卡地平预先与MKN45细胞供孵育1 h，然后加入10 nmol/L SP孵育48 h；④分别以1×10-7， 1×10-6， 1×10-5 mol/L新霉素预先与MKN45细胞供孵育1 h，然后加入10 nmol/L SP孵育48 h. 同时设立空白对照组.
　　1.2.3 细胞增殖实验 经各组药物处理后的细胞，弃上清，每孔加入200 μL新配制的5 g/L MTT，37℃继续孵育4 h，弃上清加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），混匀后用酶标仪在490 nm波长测定吸光度（A）. 肿瘤细胞增殖率=（实验孔测定值/对照孔测定值-1）×100%.
　　统计学处理： 用SPSS13.0统计软件， 所有计量资料以x±s表示， 统计分析方法采用LSDt检验， 以P&<0.05作为具有显著性差异.
　　2 结果
　　2.1 不同浓度的SP促胃癌细胞增殖作用 10，50， 100 nmol/L SP具有明显的促胃癌细胞MKN45增殖的作用. 3种不同浓度的SP促胃癌细胞的增殖率分别为：57.23%，63.75%，52.95%（P&<0.05）. 随着SP浓度的增加，SP促胃癌细胞增殖率并不显著增加，在100 nmol/L浓度时，细胞增殖率反有下降趋势（图1）.
　　2.2 不同浓度的ASN1377642对SP促胃癌细胞增殖效应的影响 用ASN1377642与MKN45预先孵育后能显著抑制SP的促胃癌细胞增殖效应. 50，250，500 nmol/L ASN1377642预先孵育后细胞的增殖率分别为24.54%，14.64%，14.23% （P&<0.05）. 随着ASN1377642浓度的增加，其抑制效应没有显著的增加（P&>0.05，图2）.
　　2.3 不同浓度的尼卡地平对SP促胃癌细胞增殖效应的影响 尼卡地平与MKN45预先孵育后能显著抑制SP的促胃癌细胞增殖效应. 1×10-7，1×10-6，1×10-5 mol/L尼卡地平预先与MKN45细胞供孵育后细胞的增殖率分别为21.88%，19.58%，19.38%（P&<0.05）. 随着尼卡地平浓度的增加，其抑制效应无显著增加（P&>0.05，图3）.
　　2.4 不同浓度的新霉素对SP促胃癌细胞增殖效应的影响 新霉素与MKN45预先孵育后能显著的抑制SP的促胃癌细胞增殖效应. 1×10-7， 1×10-6， 1×10-5 mol/L新霉素预先与MKN45细胞供孵育后细胞的增殖率分别为16.73%，14.42%，14.23% （P&<0.05）. 随着新霉素浓度的增加，其抑制效应无显著增加（P&>0.05，图4）.
　　3 讨论
　　感觉神经肽是广泛存在于中枢和外周神经中的一类神经递质，包括SP， 降钙素基因相关肽、血管活性肽等，它们影响着细胞行为，包括炎性反应、细胞增殖反应、细胞因子的合成等. SP作为一种促有丝分裂因子被人们重新认识. SP主要与其靶细胞表面的三种受体NK1， NK2， NK3结合而发挥生物学作用. SP及其受体的广泛分布特性构成了SP介导细胞增殖和分化反应的解剖和生理基础.
　　Luo等［5］运用SP刺激人星状细胞瘤细胞系U373MG发现，SP可以引起细胞DNA合成增加. 实验［6］ 表明，SP具有明显的促成纤维细胞及内皮细胞增殖作用，且该作用可以被NK1受体拮抗剂spantide抑制. 说明SP引起促有丝分裂活动是通过与NK1受体结合实现的.

　　本实验室前期已经证实胃癌细胞上有P物质特异性受体NK1的表达［7］. 我们的结果表明， SP能诱导人胃癌细胞体外增殖，并在一定范围内呈剂量依赖性，但是在100 nmol/L时其增殖率反而有所下降的机制还不清楚. 我们用不同浓度的NK1受体拮抗剂ASN1377642预先与MKN45孵育后可以显著的抑制SP对胃癌细胞MIKN45的促增殖作用，说明SP诱导的MKN45细胞的增殖是通过与其特异性的受体结合实现的. Mitsuhashi等［8］将SP受体转染到鼠KNRK细胞中发现SP的刺激可活化两条通路：细胞内游离Ca2+和cAMP均明显升高. SP与受体NK1结合后可以导致磷脂酶C活化，继而水解磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），使得肌醇三磷酸 (IP3)和甘油二脂(DAG)形成增加，IP3作用于内质网上IP3R导致内质网钙离子释放，从而升高细胞内钙离子浓度，启动DNA复制. Panner等［9］也发现，钙离子在肿瘤细胞的增殖过程中发挥了重要作用. 而Li等［10］ 在对血管平滑肌细胞的研究中也发现了该现象.
　　尼卡地平是电压门控钙通道阻断剂，我们用不同浓度的尼卡地平预先与MKN45孵育后发现其可以显著抑制SP诱导的细胞增殖. 说明钙离子可能在SP促胃癌细胞MKN45增殖过程中起了一定的作用. 新霉素是PIP2拮抗剂，我们用不同浓度的新霉素预先与胃癌细胞MKN45作用后同样可以显著的抑制SP诱导的细胞增殖，提示活化的磷脂酶C水解PIP2而产生IP3使细胞内钙离子浓度升高这条途径也参与了该增殖过程.
　　我们的结果表明，SP对胃癌细胞有促有丝分裂活性，可刺激胃癌细胞的增殖. 其促有丝分裂活性是通过其特异性受体NK1介导的. 细胞外的钙离子内流和细胞内钙库钙离子的释放可能参与了该过程，其浓度升高触发细胞的增殖. 但是SP与其受体NK1结合后的信号通路与细胞膜上的电压门控钙离子通道的关系尚不明确，仍有待于进一步的研究.

参考文献

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［9］ Panner A， Wurster RD. Ttype calcium channels and tumor proliferation ［J］. Cell Calcium，2006，40(2):253-259.

［10］ Li SJ， Sun NL. Regulation of intracellular Ca2+ and calcineurin by NO/PKG in proliferation of vascular smooth muscle cells ［J］. Acta Pharmacol Sin， 2005， 26(3):323-328.

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