关于H460细胞与单个核细胞三维立体混合培养中MMP 2和MMP 9的表达

【摘要】 目的：研究单个核细胞和肺癌细胞三维立体混合培养对MMP表达的影响. 方法：活性胶原立体培养分为H460细胞组（HG）、单个核细胞组（MG）、混合组（HMG）3组，观察癌细胞的生长状况，用明胶酶谱法测定不同时间点各组MMP2和MMP9表达. 结果：各组细胞在立体胶原内生长良好；MG未明显分泌MMP2和MMP9，HG和HMG分泌MMP2和MMP9，且HGM分泌的明显多于HG. 结论：单个核细胞和癌细胞混合培养后MMP分泌增多.
【关键词】 三维立体培养 基质金属蛋白酶 H460细胞 单个核细胞 肺肿瘤；转移
　　0 引言
　　基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）是高度保守的依赖于Ca2+和Zn2+的内切蛋白水解酶，可降解细胞外基质（extracellular matrix， ECM）中的多种成分，是肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用的酶之一［1］. 在正常稳定状态组织中，多数MMP表达量极少，而在肿瘤组织中表达量上升. 其中MMP2和MMP9均被认为是肿瘤侵袭转移的标志之一. 大量基质细胞和炎症细胞在癌组织中可以看到，但它们对肿瘤生物学特性的影响以及在肿瘤病理过程中的作用尚不清楚. 我们应用三维立体培养和明胶酶谱电泳技术，研究非小细胞肺癌细胞和单个核细胞混合培养时对MMP2和MMP9表达的影响.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 非小细胞肺癌H460细胞株由中国人民解放军总医院惠赠；CO2培养箱（德国 Heraeus公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；培养瓶和24孔培养板（美国Corning Costar公司）；电泳系统（美国Biorad公司）；DMEM培养液和胰酶（美国Gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青）；单个核细胞分离液（天津TBD公司）；蛋白质Marker（美国MBI公司）.
　　1.2 方法 截取大鼠全尾，分离出胶原丝，经平衡液和乙醇反复漂洗后，用0.4 mmol/L乙酸在4℃过夜，离心后制成20 g/L胶原溶液. H460细胞用DMEM（加100 kU/L青、链霉素）和100 mL/L新生牛血清传代培养，用第18～20代细胞做立体培养. 胰酶消化，离心，收集细胞，取少量DMEM混匀细胞，细胞计数. 另采集健康志愿者外周新鲜血20 mL，用单个核细胞分离液按照使用说明分离单个核细胞，主要是淋巴细胞和单核细胞，将收集的细胞用DMEM混匀，细胞计数.
　　1.2.1 细胞立体培养 按比例混合胶原、4×DMEM和灭菌水，使其成为等离子、等渗、1×DMEM的液体胶原，其中胶原浓度为0.75 g/L. 分H460细胞组、单个核细胞组、H460细胞和单个核细胞混合组3组接种细胞于胶原内，细胞浓度为4×108/L，以0.5 mL/孔移入24孔培养板内，待胶原固化后每孔加入DMEM培养液1 mL，在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养5 d.
　　1.2.2 MMP2和MMP9测定 按比例加入300 g/L丙烯酰胺溶液，1.5 mol/L Tris（pH 8.8），蒸馏水，明胶，100 g/L SDS，100 g/L过硫酸铵，TEMED制备100 g/L分离胶，灌注于玻璃板，待明胶聚合后灌注依比例配置的50 g/L浓缩胶，并插入Teflon梳子. 将灌制好的明胶安置于垂直电泳槽，样品用2×Tris甘氨酸电泳缓冲液等比例混匀，点样. 以恒电流方式电泳约4 h，取出明胶，按每块胶100 mL体积的25 mL/L的TritonX中浸泡2 h. 蒸馏水每100 mL加入Tris 0.56 g，用6 mol/L HCl溶液调整pH 7.50，加入CaCl2和ZnCl2制成缓冲液，将浸泡好的明胶用蒸馏水洗涤后浸入缓冲液，37℃，震荡过夜. 明胶简单洗涤后用0.4 g/L考马斯亮蓝R250染色约30 min，最后用70 mL/L乙酸，50 mL/L甲醇溶液充分洗涤至条带清晰.
　　2 结果
　　分子质量92和84 ku的条带是MMP9，分子质量是72和62 ku的条带是MMP2（图1）. 结果显示主要表达的是MMP2，还有一些小分子质量的条带是MMP9和MMP2的活化产物. 此电泳结果显示，H460组和混和组有表达，单个核细胞组未见明显表达，且HGM的表达量明显多于HG.
　　3 讨论
　　肺癌的死亡率居恶性肿瘤之首，其中肿瘤的浸润和转移是患者死亡的主要原因［2］. ECM成分的降解是肺癌细胞侵袭和转移的重要步骤. MMP2和MMP9被广泛认为是肿瘤侵袭转移的标志之一［3-4］. MMP2，MMP9即明胶酶A， B，分子质量分别为72和92 ku. MMP2和MMP9降解细胞外基质的主要成分，使得它们在细胞增殖、肿瘤侵袭和血管生成等方面有重要作用，因而与肿瘤的生长、侵袭、转移以及预后密切相关. 田东波等［5］研究结果支持MMP2比MMP9对患者预后的影响更明显的观点. 我们采用的H460细胞株来源非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer， NSCLC)，其表达也是MMP2高于MMP9. Thomas等［6］检测了10种MMP和TIMP1～4在115例NSCLC中MMP都有不同程度的表达，阳性率41％～68％，基质表达阳性率6％～87％，而相邻的正常支气管上皮细胞的表达率仅1%～28％. Coussens等［7］研究认为MMP9由白细胞等多种细胞分泌，而肿瘤及其周围的白细胞均来自于外周血白细胞. 明树红等［8］研究结果也显示外周血白细胞MMP9 mRNA的表达与血浆中MMP9蛋白水平呈正相关，认为肺癌患者血浆中MMP9蛋白至少部分来自外周血白细胞的分泌. 这些研究提示我们在肿瘤侵袭与转移过程中MMP的分泌不仅仅来源于肿瘤细胞，间质细胞等都有明显的协同作用. 我们研究发现单个核细胞组不（或很少）表达MMP，而将单个核细胞和H460细胞混和培养后MMP的表达量明显增多，并且多于单纯的H460细胞组的表达量，这提示我们在肿瘤病理过程中，癌组织中的间质细胞尤其是炎症细胞， 可能在肿瘤细胞的刺激下分泌MMP，并且分泌的MMP被活化，而MMP在组织中的活性增强，促进了周围组织中促胶原成分的降解，使得周围组织细胞间的紧密连接出现松解，有利于癌组织中的癌细胞游离并向外周组织迁移，进而促进了肿瘤的生长、侵袭与转移. 马进安等［9］研究结果显示， NSCLC间质中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、 肥大细胞（MCs）和趋化因子白细胞介素8（IL8）、 单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、巨噬细胞炎性蛋白1（MIP1）能够相互协同，共同促进肿瘤血管的生成. 这项研究和我们的研究都提示肿瘤组织中的炎性细胞和细胞因子对肿瘤的生长、侵袭有协同作用，然而MMP是如何激活基质成分、间质细胞，以及它们在肿瘤病理过程中的作用如何，还有待于进一步研究.

【参考文献】
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［5］ 田东波， 胡国洪， 肖伟民， 等. MMP2、MMP9在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理特征的关系［J］. 现代临床医学生物工程学杂志， 2005， 11(3): 170-173.

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［7］ Coussens LM， Tinkle CL， Hanahan D， et al. MMP9 supplied by bone marrowderived cells contributes to skin carcinogenesis［J］. Cell， 2000， 103: 481-490.

［8］ 明树红， 孙铁英， 肖 伟， 等. 基质金属蛋白酶2， 9及其抑制剂1在肺癌侵袭转移中的作用［J］. 中国呼吸与危重监护杂志， 2005， 4(3): 198-202.

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