关于精氨酸对急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响

【摘要】 目的: 探讨左旋精氨酸与急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的关系. 方法: 以蛙皮素制造AP模型，观察不同剂量LArg治疗AP大鼠后，胰腺组织中一氧化氮合酶（NOS）活性、一氧化氮(NO)的含量、胰腺腺泡细胞凋亡及胰腺组织病理改变. 结果: AP胰腺组织中NOS活性较正常胰腺组织中升高，而此时胰腺组织NO浓度反而降低，低剂量LArg（75， 150 mg/kg）使胰腺组织中NO浓度升高致接近正常组水平，促进了胰腺腺泡细胞凋亡，减轻胰腺病理损害；高LArg剂量（1200， 2400 mg/kg），胰腺组织中NO浓度升高超出正常组，胰腺腺泡细胞凋亡减少，胰腺病理损害加重. 结论: LArg对AP的的双重作用与NO的生物活性有关. 小剂量可通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡， 而起保护作用， 大剂量则有害.
【关键词】 胰腺炎 细胞凋亡 左旋精氨酸
　　0引言
　　近年来人们注意到轻症急性胰腺炎(AP)的胰腺腺泡细胞中存在着较多的细胞凋亡， 而急性坏死型胰腺炎(ＡＮＰ)却很少出现细胞凋亡. 这提示细胞凋亡在ＡＰ发展成ＡＮＰ的发病机制和发展过程中起着一定作用［1］. 精氨酸（Arg）及其在体内的代谢产物NO，对AP起一定的保护作用，可能是治疗AP的一条新途径［2-3］. 一氧化氮（NO）作为一种信息分子参与了多种组织和细胞的凋亡过程，其生物作用随浓度变化而截然不同. 为了探讨NO的供体左旋精氨酸（LArg）治疗AP的作用，我们观察了倍数剂量LArg治疗AP大鼠后，胰腺组织中NOS活性、NO的含量、胰腺腺泡细胞凋亡及胰腺组织病理的变化.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　健康成年SD大鼠90只（陕西省中医研究院实验动物中心提供），体质量180~240 g(平均196±5) g. 按体质量统一编号，然后随机等分为9组：假手术组（A组）、AEP（B组）、生理盐水治疗组（C组）、LArg 75， 150， 300， 600， 1200， 2400 mg/kg体质量治疗组（D， E， F， G， H， I组）. 蛙皮素购自美国Sigma公司，左旋精氨酸(LARG) 购自上海信谊制药厂，经生理盐水稀释为25%溶液后使用， 原位凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司).
　　1.2方法
　　1.2.1模型制备与用药所有实验动物术前12 h禁食，自由饮水，称取体质量后，50 g/L戊巴比妥（4 mL/kg）肌肉注射麻醉. 以腹腔内注射蛙皮素50.0 μg/kg，1次/h，连续2次，制造AEP模型，假手术组注射生理盐水. 4 h后经颈静脉注射LArg(上海信谊制药厂 批号990302，经生理盐水稀释为25%溶液后使用). 其后12 h采取断颈方法处死动物，剖腹取材. 所取胰腺组织分成两部分：一部分以40 g/L甲醛固定，用于胰腺组织形态观察，并用TUNEL方法检测胰腺组织细胞凋亡；一部分制成匀浆，-20℃保存，用于测定胰腺组织ＮＯＳ活性、ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度.
　　1.2.2观察指标
　　①采取相同部位的胰腺组织固定于40 g/L甲醛溶液，常规方法制作病理切片，HE染色，光镜下观察. 胰腺炎组胰腺组织呈炎性改变. 对照组胰腺组织细胞正常. 采用改良Grewal等［4］的方法对胰腺炎组织损伤进行定量评估. 水肿:0分=无水肿;1分=轻度叶间隙增宽;2分=重度叶间隙增宽;3分=腺泡间隙增宽;4分=细胞间隙增宽. 坏死:0分=无坏死;1分=坏死面积1%～10%;2分=坏死面积11%～20%;3分=坏死面积21%～30%;4分=坏死面积&>30%. 炎症:以每高倍视野计，每5个炎细胞计0.5分，超过30个计4分. 出血:0分=无出血;1分=有出血.②采用TUNEL方法检测胰腺组织细胞凋亡，染色步骤按说明书进行. 在光镜下，根据调亡细胞的形态特征判断调亡细胞：单个腺泡细胞，周围无炎症反应坏死，胞质收缩，细胞核呈棕黄色颗粒或核碎片，每张切片随机选择５~１０个高倍视野，计数１０００个腺泡细胞中的凋亡细胞，用百分数表示，作为凋亡指数（ＡＩ）.③胰腺组织ＮＯＳ活性测定: NOS活性测定采用南京建成生物工程研究所提供的NOS试剂盒， 按说明书操作. S500 P紫外光可见光连续光谱分光光度计比色， 波长为530 nm.④取胰腺组织２００ ｍｇ，加入ＰＢＳ缓冲液（０.０２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７.４）匀浆至２ ｍL，离心后取上清０.１ ｍL，以酶法（南京建成生物制品研究所试剂盒），按说明书步骤测定ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度，间接反映ＮＯ浓度. 　　统计学处理: 所有实验结果以x±s表示，组间比较采用SPSS 8.0统计软件作单因素方差分析及两两比较. P&<0.05认为具有统计学意义.
　　２结果
　　2.1病理观察正常组胰腺肉眼及光镜下均未见明显病理变化，AP组胰腺组织中炎症细胞浸润，腺细胞肿胀，点状坏死，间质水肿. 胰腺组织光镜下病理评分见表1. AP及各治疗组中组病理评分高于正常组（P&<0.05），其中D， E， F组明显低于B组，而H， I组高于B组.表1胰腺组织光镜下病理评分（略）
　　2.2胰腺组织中NOS活性、ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度、腺泡细胞凋亡AP及各治疗组中组NOS活性高于正常组（P&<0.05）， 各组间NOS活性无统计学差异（P&>0.05）. B， C组ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度明显低于A组（P&<0.05），LArg治疗组ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度，均高于正常及AP组（P&<0.05），其中H， I组分别高于D， E组； AEP及各治疗组中组凋亡指数高于正常组（P&<0.05），其中D， E， F， G组AI高于B组，而H， I组AI低于B组（P&<0.05， 表2）.表2各组胰腺组织中NOS水平、ＮＯ２－／ＮＯ３－浓度、腺泡细胞凋亡指数（略）
　　3讨论
　　AP是普外科临床的常见急腹症之一， 近年来发病率逐渐升高， 临床表现凶险，常合并器官功能障碍，病死率高，目前仍属于难治性疾病之一. 一般认为，胰腺炎发生后出现的炎性细胞聚集和炎性介质(即所谓“瀑布样效应”)是影响胰腺炎病情的主要因素. 然而，最新的研究报告指出，胰腺炎发生时最早的病理变化出现在胰腺腺泡细胞内， 腺泡细胞本身对损伤的反应是决定“瀑布样效应”程度及病情轻重的决定性因素之一. AP时，胰腺细胞受损，细胞存在凋亡和坏死两种不同的死亡形式，其中腺泡细胞凋亡是机体的一种自我保护机制. AP时，受损的胰腺腺泡细胞发生死亡，如果以坏死方式进行，细胞内多种成分（多种酶原、细胞器等）释放出来，会产生“瀑布样效应”，并伴随剧烈的炎症反应，从而诱发急性重症胰腺炎，致敏的中性粒细胞和大量的炎性介质造成机体产生全身炎性反应综合征（SIRS） 如不及时终止其发展，则可进一步导致多脏器功能不全综合征（MODS），甚至多脏器功能衰竭（MOF）. 坏死细胞越多，则胰腺炎病情越重. 如果受损的胰腺腺泡细胞以凋亡方式进行，细胞内多种成分不外泄，形成凋亡小体，被巨噬细胞等吞噬周围炎症反应轻，胰腺炎病情较轻［5］. 本研究结果证明在凋亡指数低， 胰腺病理损害较严重， 如果能调控凋亡的强弱，有可能在急性胰腺炎的治疗方面开辟一个新的领域.
　　本研究表明，急性水肿性胰腺炎（AEP）时胰腺组织中NOS活性较正常胰腺组织中明显升高，而此时胰腺组织NO浓度反而降低，提示胰腺组织NO浓度降低是由于作为NO惟一供体的LArg耗竭引起的. 我们采用剂量呈倍数梯度增加的LArg治疗AEP大鼠后发现，低剂量LArg（75， 150 mg/kg）使胰腺组织中NO浓度升高致正常组相近的水平，其细胞保护作用占优势， 促进了胰腺腺泡细胞凋亡，从而减轻胰腺病理损害. 随着LArg剂量（1200， 2400 mg/kg）的增加，当胰腺组织中NO浓度升高超出正常组，细胞毒性作用占优势， 胰腺腺泡细胞凋亡减少，胰腺病理损害加重，表现为坏死.
　　本实验结果提示， LArg对AP的的双重作用与NO的生物活性有关. 小剂量可通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡， 而起保护作用， 大剂量则有害.

参考文献

　　［1］Kaiser AM， Salugi AK， Sengupta A， et al. Relation between severity necrosis， and apoptosis in five models of experiment acute pancreatitis［J］. Am J Physiol， 1995， 269(Part 5): 1295-1305.

　　［2］Werner J， Revera J， Castilllo CF， et al. Differing roles of nitric oxide in the pathogenesis of acute edematous versus necrotizing pancreatitis［J］. Surgery， 1997， 121(1):23-27.

　　［3］李广阔，张肇达，刘续宝，等. 左旋精氨酸对急性胰腺炎的作用［J］. 中华实验外科杂志， 1999， 16（2）:161-163.

　　［4］Grewal HP， Moheyel Din A， Gaber L， et al.Ameliomoration of the physiologicand biochemical changes of acute pancreatitis using an antiTNFαpolyclonal antibody ［J］. Am J Surg，1994，167:214.

　　［5］周五一， 杨燕， 周杰. 凋亡相关基因Ｂａｘ，Ｂｃｌ2在大鼠急性胰腺炎中表达的研究［J］. 中国现代医学杂志， 2002， 12(11):14.