作者：张美玲，金利泰，朱忠欣，李杨玲，李校
【摘要】 目的：比较7种可见染色法对特殊蛋白灵敏度的检测差异。方法：采用一向电泳分离5种蛋白，1种为普通蛋白，其他4种为糖蛋白或磷蛋白代表。考察比较传统考马斯亮蓝染色、UPS染色、BYT-银染、YAN-银染、BIO-银染以及UPS1-银染，UPS2-银染7种可见染色方法对特殊蛋白灵敏度检测的差异。结果：7种可见染色法的共同点是对普通蛋白的灵敏度都要高于特殊蛋白。染料染色中UPS染色优于传统考染，5种银染法中UPS1-银染染出的蛋白条带均一性较强且背景清晰，UPS2-银染次之。结论:考察的7种可见染色法对特殊蛋白的染色结果显示，UPS1-银染染色时间较短，灵敏度最高。
【关键词】 可见染色;特殊蛋白;灵敏度
蛋白质翻译后修饰研究是蛋白质组学的一项重要任务[1]。目前蛋白质翻译后修饰的研究面临的问题之一是翻译后修饰的蛋白非常微量，因此检测这些特殊蛋白需要高灵敏度的方法[2-3]。经分离后的蛋白质需借助染色技术加以识别，胶体上蛋白质的染色技术是一项关键的技术，对蛋白质组学研究的水平和成败产生极其重要的影响。目前多数实验室采用的染色法以考染和银染为主，本研究选用传统考马斯亮蓝染色、UPS染色、YAN-银染、UPS1-银染、UPS2-银染、BIO-银染、BYT-银染7种可见染色方法[4-8]，分析了这7种染色法对5种蛋白(其中 BSA为普通蛋白，Albumin，α-acid glycoprotein为糖蛋白，α-casein，β-casein为磷蛋白)灵敏度，蛋白条带均一性、操作性等方面的比较，希望为广大生物研究人员提供一定的参考价值。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器：DYY-6C 电泳仪(北京六一仪器厂);脱色摇床(北京六一仪器厂);Powerlook 2100XL扫描仪(美国UMAX公司)。
1.1.2 试剂：BSA，Albumin，α-casein，β-casein、α-acid glycoprotein，CBBR250、，丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、尿素、过硫酸铵(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(N，N，N’，N’-Tetramethylethylenediamine)、TEMED、均购自Sigma公司，3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(3-(3-(Cholamidopropyl)dimethylammonio)propanesul-fonate，CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、硝酸银、碳酸钾进口分装，UPS-染色试剂盒、UPS1-银染试剂盒、UPS2银染试剂盒购于温州安得森生物科技有限公司，BYT-银染试剂盒购于碧云天生物技术研究所。
1.2 方法
1.2.1 蛋白溶解：精密称取BSA，Albumin，α-casein，β-casein，α-acid glycoprotein各1 mg，于1 mL 2×凝胶上样缓冲液(62.5 mmol/L Tris HCl pH 6.8，2% SDS，5% 2-巯基乙醇，10%甘油，0.002%的溴酚蓝)溶解混匀，分装，-80 ℃保存。
1.2.2 凝胶电泳：分离胶12%，浓缩胶4%，梳子厚度1.0 mm，将样品对倍稀释，传统考马斯亮蓝染色和UPS染色的上样浓度依次为：1 000、500、250、125、62.5、32、16、8、4、2 ng/band，银染上样浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2 ng/band.稳压120 V，电泳100 min。
1.2.3 染色：传统考马斯亮蓝染色、UPS染色、YAN-银染、UPS1-银染、UPS2-银染、BIO-银染、BYT-银染7种可见染色方法[4-8]操作步骤见
参考文献
或说明书。1.3 统计学处理方法 将染色结果用Powerlook 2100XL扫描仪进行扫描，采用TINA(2.09)软件对扫描图中所有蛋白质条带的灰度值进行测量，取平均值，然后以灰度值对蛋白量作相关系数图。
2 结果
2.1 凝胶背景和灵敏度等的比较 通过对7种可见染色法对特殊蛋白染色结果的比较发现(见图1)：UPS染色灵敏度可达4 ng/band，而传统考染的可见灵敏度仅为10 ng/band;EZ染色染色时间短，1个小时可完成操作，并且无需用到甲醇，对环境无污染。5种银染法中，特殊蛋白的灵敏度集中在0.2～1 ng间;UPS1-银染灵敏度可达0.1 ng，染色背景清晰，条带均一性较强;UPS2-银染操作时间可控制在1个小时内，但背景较深;BIO-银染整体蛋白条带不够均一，灵敏度在0.8 ng左右;YAN-银染虽然灵敏度能达到0.1 ng，但是背景容易出现纵条纹，具体比较见表1。
2.2 直线动态范围 7种可见染色法染出α-casein的蛋白量对应的灰度值的线性回归系数关系(见图2)。直线性范围中染料染色法考察的蛋白量为(30～1 000 ng)，不同银染法考察蛋白量为(0.8～100 ng)。
3 讨论
蛋白质翻译后修饰是蛋白质行使正常生理功能所必需的。对这种修饰后蛋白的研究已吸引了许多蛋白质组学研究成员，本研究选取的糖蛋白Albumin含碳量为3～4%，α-acid glycoprotein的含碳量为39～42%，磷蛋白α-casein含有8个磷酸根基团，β-casein含有5个磷酸根基团。染色结果进行分析表明普通蛋白的灵敏度要高于特殊蛋白，这很有可能与特殊蛋白的结构相关，但是其内在的机制有待于做进一步的研究。
5种银染法中，UPS1-银染优势较明显，该染色方法是以离子对技术和银离子敏化作用为理论基础的一种新型蛋白质检测技术，具有染色时间短，灵敏度高，低毒等优点。因为很多特异性蛋白和功能性蛋白都集中在低丰度蛋白区，这就需要较高灵敏度的染色方法，该染色法较其他几种方法能更多地发现有意义性的蛋白，能更好地衔接蛋白质组学的后续研究。
参考文献
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