作者：苏玉虹，刘东鑫，宋慧娟，曾瑞霞，巴彩凤，王洪才
【摘要】 目的 克隆猪Calsarcin-2（Cs-2）基因，并探讨其在猪组织中的表达特点。方法 利用RT-PCR方法扩增猪Cs-2基因编码区的序列；采用Northern 杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同组织和不同部位骨骼肌中分析Cs-2基因表达情况及转录本个数、大小。结果 猪Cs-2基因片段长934 bp，含有1个897 bp的开放阅读框（ORF），编码298个氨基酸，与已报到的人Cs-2基因氨基酸序列相似性为93%；猪Cs-2基因仅在骨骼肌中表达，不同骨骼肌中表达量有所不同，以背最长肌最高；此基因在骨骼肌中只有一个转录本，大小为1.26 kb。结论 猪Cs-2基因序列与已报道的人、鼠Cs-2基因具有高度同源性，主要在骨骼肌中特异表达。
【关键词】 猪；Cs-2基因；组织表达谱
Cloning of Encoding Region and Analysis of Tissue Expression
Profile of Pig Calsarcin-2 GeneSU Yuhong， LIU Dongxin， SONG Huijuan，
ZENG Ruixia， BA Caifeng， WANG Hongcai
(Liaoning Medical University， Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective To clone swine Cs-2 gene and to investigate the character of tissue expression in pigs. Methods The sequence of porcine gene Cs-2 was amplified by RT-PCR. The numbers and size of porcine Cs-2 transcripts in skeletal muscle were obtained with Northern blotting and the expression levels in multiple tissues were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results The length of porcine Cs-2 cDNA was 934 bp containing an ORF of 897 bp， which encoded a 166 amino acids. Homology of amino acids sequence between the amplified porcine and the reported human Cs-2 was 93%. There was only one transcript among different skeletal muscles whose size was nearly 1.26 kb， but not detected in the other tissues including heart，liver，spleen，lung and kidney.The expression levels of Cs-2 gene varied among different skeletal muscles. It was the highest expression in musculus longissimus dorsi. Conclusions There are great similarities in the porcine Cs-2 gene， human gene and murine Cs-2 gene， which are expressed mainly in skeletal muscles.
Key words：pig; Cs-2; tissue expression profile
猪肉是人类蛋白质主要来源之一，其基本组成单位是肌纤维，与肉质性状存在相关性。
研究发现：不同品种猪的肌纤维类型转化规律基本一致，但转化率不同，肌肉代谢束内肌纤维类型的组成直接影响全身肌肉量和食用品质。肌肉中红肌纤维（慢反应纤维）所占比例越大，白肌纤维（快反应纤维）所占比例越小，肌肉品质相对就越好［1］。很多基因及其产物影响肌肉的肌纤维类型。有报道指出活化的钙调磷酸酶促进慢反应纤维基因表达［2］。Frey等以钙调磷酸酶的催化亚基和半乳糖基因激活转录因子的DNA结合结构域组成的融合蛋白为诱饵，双杂交筛选出Calsarcin基因家族的2个成员：Cs-1，Cs-2；Calsarcin蛋白家族能同钙调节酶催化亚基相互作用，诱导细胞内信号传导，调节快慢骨骼肌纤维之间的转化［3］。人、鼠的Cs-2基因主要在骨骼肌快反应纤维中表达，人中转录体大小约为1.5 kb，鼠的约为1.35 kb。利用比较基因组学方法，本课题组2006年克隆了猪Cs-2基因，并初步分析了该基因的结构与功能［4］。本研究在上述工作基础上对猪Cs-2基因进行组织表达谱分析，为进一步研究此基因的结构与功能提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验样品
采集同品种、同日龄、同环境饲养的三头成年本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织。所有组织样品采集后迅速置于液氮中冷冻后-80 ℃保存。
1.2 总RNA的提取
采用Trizol一步法提取3头本地大白猪不同组织的总RNA。
苏玉虹，等：猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析辽宁医学院学报 2008年10月，29(5)1.3 利用电子克隆策略设计引物
以人的同源基因cDNA为信息探针，利用BLAST工具在猪EST数据库中调取同源性序列（标准:长度≥200 bp，相似性≥80%）。筛选出的ESTs利用Gene Tool 2.0软件进行拼接，以拼接序列重叠群为模板，综合考虑引物设计的各项原则，在Primer Premier 5.0软件中设计引物扩增ORF全长序列。引物序列及退火温度如下：CS2-F：5＇-TCCACAATGCCGCTCT-3＇，
CS2-R：5＇-GAATCATGATGCAAAGG-3＇，退火温度51℃。
1.4 RT-PCR 反应
首先以Oligo(dt)15为引物，反转录酶催化cDNA第一链的合成；其次，以cDNA第一链为模板，以CS2为引物进行RT-PCR，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 PCR产物的克隆与测序
PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化后，与pMD18-T Vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用α互补作用筛选白色菌落。用碱裂解法抽提质粒，经PCR及EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切鉴定，阳性质粒送上海生工进行双向测序。细菌转化、质粒抽提、酶切鉴定均按分子克隆实验指南［5］稍加修改进行。
1.6 Northern杂交
按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit说明书进行操作。以CS2引物扩增的934 bp片段标记地高辛作为探针来杂交本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织的总RNA。
1.7 组织表达谱分析
利用半定量RT-PCR方法检测Cs-2基因在本地大白猪4个非肌肉组织（肝、脾、肺、肾）及5个不同部位肌肉组织（心肌、股二头肌、头半棘肌、背最长肌和内脊肌）中的表达丰度。为避免基因组污染，利用猪管家基因GAPDH作内标，以CS2引物扩增条带亮度与内标的比值作为表达丰度。GAPDH基因(GenBank登录号为AF017079)引物序列如下：正向引物：5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3’，反向引物：5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3’。PCR结束后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并利用图像分析软件Gene Tools分析结果。
2 结 果
2.1 RT-PCR 扩增结果
图1所示，在三头本地大白猪的背最长肌组织中，CS2引物的RT-PCR扩增特异性条带位于900 -1000 bp之间，大小与预期结果一致。
2.2 阳性克隆子的双酶切鉴定
引物CS2的扩增产物与载体连接后转化到大肠杆菌内，提取的质粒经EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切后，10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。由图2可知，双酶切产物与PCR扩增产物一致，表明所提取质粒中含有扩增的目的片段。
2.3 猪Cs-2基因的测序与分析
2.3.1 cDNA序列及相似性
将扩增片段双向测序后，用Sequencher 4.1.4软件拼接，得到一条934 bp的cDNA整合序列，并提交到GenBank，登录号为DQ058294。该cDNA序列包括897 bp的全长CDS序列，编码298个氨基酸。根据物种间剪切位点的保守性分析，获得了该序列5个外显子的连接点，如图3所示。将此CDS序列与人Cs-2基因cDNA序列（GenBank登录号为NM_021245）和小鼠Cs-2基因cDNA序列（GenBank登录号为NM_021508）进行BLAST比对，结果显示它们之间的相似性分别为91%和87%。至此，可将克隆、拼接得到的934 bp的基因片段命名为猪Cs-2基因。下划线部分为起始密码子和终止密码子；斜体加黑部分为预测的猪Cs-2基因外显子的连接部位
2.3.2 氨基酸序列分析
由猪Cs-2基因ORF推导的氨基酸序列与人、小鼠Cs-2基因的氨基酸序列之间的相似性分别为93%和89.6%，说明Cs-2蛋白在哺乳动物中相当保守。此外，Cs-2蛋白同人、鼠的calsarcin家族的其它两个成员比较发现：calsarcin家族成员的氨基端和羧基端的氨基酸序列比较保守，中间的氨基酸变化较大。Prosite数据库搜索发现Cs-2蛋白存在多种模序，有天冬氨酸糖基化位点，葡萄糖胺聚糖结合位点，十四(烷)酰化位点，酰胺化位点及多种磷酸化位点，包括蛋白酶C磷酸化位点，依赖于cAMP、cGMP蛋白磷酸化位点以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点。经SOPMA软件预测，其二级结构为：α-螺旋占16.44%；β-转角占8.39%；延伸链占18.79%；无规卷曲占56.38%。
2.4 Northern 杂交
探针与本地大白猪的背最长肌、内脊肌、头半棘肌及股二头肌总RNA的杂交图均可见杂交信号带，显示该基因在肌肉组织中只有一个转录本，约为1.26 kb，但在心、肝、脾、肺、肾组织中不表达。杂交结果见图4。 M：地高辛标记的RNA Marker；1-9：分别为探针与肾、肝、脾、心、头半棘肌、内脊肌、肺、背最长肌和股二头肌总RNA的杂交带
2.5 组织表达谱分析
利用CS2引物对本地大白猪心、肝、脾、肺、肾以及不同肌肉组织进行RT-PCR扩增，结果见图5。由图5可知Cs-2基因主要在肌肉中表达，在其它组织中未见表达，这与Northern的结果相一致。利用图像分析软件Gene Tools分析该基因在不同肌肉组织中的表达丰度，结果显示，该基因在背最长肌表达量最高，股二头肌次之，内脊肌、头半棘肌表达量相当。M：DNA Marker DL2000；1：肾；2：肺；3：脾；4：肝；5：心；6：股二头肌；7：背最长及肌；8：内脊肌；9：头半棘肌
3 讨 论
本研究利用比较基因组学原理，采用RT-PCR方法成功的从猪肌肉组织中克隆得到Cs-2基因的编码区序列，并进行测序。通过EST数据库搜索，Cs-2基因在大多数哺乳动物中表达，而果蝇和非哺乳动物不表达，说明该基因是哺乳动物肌细胞的一个重要组成成分。猪Cs-2氨基酸序列同人、鼠Cs-2氨基酸序列比对发现它们之间同源性非常高，分别为93%和89.6%，所以我们有理由相信人、鼠和猪的Cs-2蛋白具有相似的生物学功能。目前基于人、鼠研究，Cs-2 蛋白具有两方面的功能：一方面，能同钙调磷酸酶相互作用，调节其活性。钙调磷酸酶在多种类型的细胞信号传导中发挥着重要作用。最近研究表明：在骨骼肌细胞和心肌细胞中，钙调磷酸酶能调节快反应纤维向慢反应纤维转化，并且Cs-2蛋白也参与了这一信号转导过程［3］14634。另一方面它是Z线的组成性蛋白，分布在Z线边缘，同Z线其它组成性蛋白相互作用，构成具有特定结构蛋白三维复合体，该复合体对Z线的形成和稳定起到了重要作用，进而影响肌细胞的发育与分化。某些蛋白激酶C的同工酶通过ZASP蛋白的LIM结构域锚定在Z线上［6］，Cs-2蛋白也能同ZASP相互作用，这是否是Cs-2蛋白参与的又一信号通路很值得研究。
Prosite 数据库搜索发现猪Cs-2蛋白具有很多磷酸化位点，比较重要的有蛋白酶C磷酸化位点，依赖于cAMP、cGMP蛋白磷酸化位点以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点，这些磷酸化位点也许同Cs-2蛋白参与的信号通路有关。
本研究中Northern 杂交的结果显示，猪Cs-2基因仅在骨骼肌中表达，不受部位限制，只有一个转录本，约为1.26 kb，进一步说明该基因是猪骨骼肌细胞的特异性基因，参与肌肉发生和代谢等功能。多组织RT-PCR结果表明猪肌肉中Cs-2基因的表达丰度以背最长肌最高，此肌肉为快反应纤维，初步说明Cs-2对钙调磷酸酶的活性有抑制作用，间接调节不同类型肌纤维的属性。但功能到底如何，需要进一步分析Cs-2基因和肌纤维类型的相互关系。
本研究结果为在动物整体水平上建立Cs-2基因敲除的转基因小鼠，通过对不同骨骼肌纤维分子组成和属性的鉴定，进一步确定Cs-2基因同骨骼肌纤维类型的关系提供了理论与实验数据。
参考文献
［1］ 王继英，王怀中，张印. 猪肌纤维特性的研究进展 ［J］. 养猪，2004，3: 46-48.
［2］ Molkentin JD， Lu JR， Antos CL， et al. A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy ［J］. Cell， 1998， 93 (2) : 215-228.
［3］ Frey N， Richardson JA， Olson EN. Calsarcins， a novel family of sarcomeric calcineurin-binding proteins ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2000， 97 (26) : 14632-14637.
［4］ 刘东鑫，朱宝芹，巴彩凤，等.猪Calsarcin-2基因cDNA的克隆与测序 ［J］.现代畜牧兽医，2006，4：19-21.
［5］ 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W著. 黄培堂等译. 分子克隆实验指南［M］. 第3版.北京：科学出版社，2002：27-30.
［6］ Robia SL， Ghanta J， Robu VG， et al. Localization and kinetics of protein kinase C-epsilon anchoring in cardiac myocytes ［J］. Biophys J， 2001， 80 (5) : 2140-2151.