作者：王青青， 李伟宏，常志杰，焦金菊
【摘要】 目的 探讨培养兔主动脉平滑肌细胞的方法，为心血管疾病的病因机制研究提供有用的体外模型。方法 采用组织块贴壁、反转干涸方法培养兔主动脉平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下进行形态学观察及免疫细胞化学鉴定。结果 成功培养兔血管平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下细胞呈典型的“峰-谷”状。免疫细胞化学染色呈棕黄色，均呈阳性表达，胞浆内可见纵行排列肌丝。结论 利用组织块贴壁、反转干涸方法成功进行兔主动脉平滑肌细胞原代培养， 具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点，是心血管疾病良好的体外研究模型。
【关键词】 血管平滑肌细胞; 原代培养; 兔
Abstrct:Objective To discuss the method for primary culture of rabbit arterial smooth muscle cells.To provide useful vitro model for the etiopathogenisis of cardiac vascular diseases. Methods Rabbit arterial smooth muscle cells were cultured with tissue explants adherent and back to roll depletive method and could be passaged.The form of rabbit arterial smooth muscle cells were observed under inverted phase contrast microscope and were identified with the method of immunocytochemistry. Results Rabbit arterial smooth muscle cells were cultured successfully with tissue explants adherent and back to roll depletive method and could be passaged.Under inverted phase contrast microscope，the growth of the cells showed a typical hill-and-vally pattern.After immunocytochemistry staining，all the cells cytoplasm were stained and positive.Lots of stained buffy actin filament bundles were observed in cell cytoplasm. Conclusions The culture techenique of tissue explants adherent method has the advantages of easy to operate， high efficiency to obtain VSMCs in a shorter cycle time， high purity and so on.They are good vitro model of cardiac vascular diseases.
Key words:VSMCs;primary culture;rabbit
近年来，越来越多的证据表明血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ，VSMCs)增殖在冠状动脉粥样硬化、高血压病等疾病的发生发展中起重要作用。因此，体外培养VSMCs为探索临床治疗干预途径提供了一个良好的实验对象。目前，培养大鼠、小鼠VSMCs的报道较多，而培养兔VSMCs的报道相对较少，本实验在参照文献［1-3］的基础上，结合自已的一些经验，成功培养兔主动脉平滑肌细胞并传代。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康日本大耳兔，雌性，1.0～1.5 kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.1.2 培养材料和试剂 高糖DMEM培养液，1∶250胰蛋白酶（美国sigma公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物科技责任公司），小鼠抗兔α- 平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，即用型SABC试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司），一次性培养瓶(美国Corning)。
1.2 方法
1.2.1 获取兔主动脉平滑肌细胞 取健康日本大耳兔1只，空气栓塞致死，无菌条件下取出主动脉，放入装有培养液的培养皿中，PBS反复清洗血迹，干净后用小镊子剥除外膜纤维结缔组织，用眼科剪将血管纵行剪开，平铺在培养皿中，使内表面朝上，用眼科弯镊刮除血管内膜，以去除内皮细胞，剩余血管中膜组织透明、较薄、韧性好，浸泡于PBS中并冲洗干净，而后移入10 mL小瓶中，加入1 mL培养液，剪成约1 mm3的组织块，将其移入培养瓶，摆布均匀，翻转培养瓶，使瓶底向上，组织块位于培养瓶上方，加入4～5 mL含20％FBS的DMEM培养液，旋松瓶口，放入CO2孵箱培养。3～4 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，绝对静置培养3 d。4～6 d后换液，可见散在、梭形细胞从组织块边缘爬出。8～10 d出现致密细胞层，隔天换液1次。
1.2.2 细胞传代培养 细胞生长融合成致密单层细胞时即可传代。倾去原培养液，PBS洗涤瓶壁细胞2～3 次，0.25％胰蛋白酶溶液消化，室温2～3 min，初次消化细胞敏感，30 s即可。镜下见大部分细胞收缩，边缘清楚时，翻转培养瓶停止消化，倒去消化液，加入培养液终止消化。反复吹打瓶壁细胞，使其脱落，制成单细胞悬液，接种于新培养瓶，以细胞量决定分装比例，补足培养液，置于孵箱培养。次日换液，细胞铺满瓶底时（约2～4 d），依同法传代。
1.2.3 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。
1.2.4 免疫细胞化学鉴定 小鼠抗兔α- 平滑肌肌动蛋白单克隆抗体；生物素化山羊抗小鼠IgG(即用型SABC试剂盒）。本实验采用SABC法对第3代VSMC与爬片进行免疫细胞化学染色。
1.2.5 细胞冻存和复苏 选生长良好的第4代细胞进行冻存，将封闭好的冻存管依次放入4℃，60 min;-20℃，4 h;-70～-80℃，2个月。复苏后细胞形态和性状保持不变。
2 结 果
2.1 倒置相差显微镜观察
原代培养于3～4 d可见组织块边缘有细胞游离，不同组织块细胞游离时间略有差别，细胞逐渐生长形成细胞晕，相互接触形成细胞簇。原代细胞呈梭形，束状排列，平行生长，典型“峰—谷”样生长，成“峰”部位细胞密集生长，而成“谷”部位细胞密度相对较小，甚至无细胞(图1)。传代间隔期一般2～4 d，接种于培养瓶中大约6 h， 多数细胞已伸展贴壁。当细胞生长融合后，细胞间平行排列成束，或成放射状排列，高低起伏，“峰—谷”状生长特点更为明显。传代细胞形态多样，呈梭形，星形，带状，多角形和不规则形，大小有差异，其胞核呈卵圆形或圆形， 核中有1～6个大小不一深色核仁， 胞浆丰富， 含少量暗黑色颗粒，可见双核或三核。
2.2 免疫细胞化学鉴定结果
镜下见所有细胞均染色，呈阳性，即胞浆呈棕黄色，胞质中可见明显条丝状物，不复染的细胞核不着色（图2），苏木素复染后细胞核为淡蓝色（图3）。
3 讨 论
与酶消化法［4，5］相比，组织块法经济、实用、污染机会少。培养过程中应注意一些问题：首先，动物要选较年幼的，这样从一开始就保证了细胞的生长力。溶液pH值以7.0～7.2为宜，大部分细胞耐酸不耐碱，VSMCs更是如此。血清是VSMCs原代培养成功与否的关键，应选较高浓度胎牛血清（20%），首次传代宜用稍高的细胞接种密度和较高胎牛血清浓度(15%～20%)，可获得较好活力的VSMCs，以利于传代培养中保持较好的生长性状，以后的传代培养，血清浓度可维持在10%，如浓度过低则表现为细胞变薄，折光性差，生长缓慢或停止生长，“峰—谷”状特征消失，甚至大量死亡，中途更换血清亦可导致其死亡。其次，取材要严格无菌，力求迅速。再次，翻瓶过早组织块未贴住，过晚细胞游离较晚甚至无细胞游离，经多次尝试，发现培养瓶中如有液体则3.5～4 h翻瓶相对较佳；如无液体则2 h翻瓶较好。还有，传代时机应选在细胞出现致密层或局部细胞交错重叠生长时，根据细胞量决定传代比例。原代细胞获得率较高，而传代过程细胞死亡率较高，故应选在细胞增殖期、生长状况较好时传代， 最好1∶2传代， 比例过大细胞存活率低。最后，组织块过密或过疏都影响细胞生长，间距以0.3 cm为佳。反复贴壁的组织块几乎无细胞生长，以一次贴壁生长情况最好，未贴壁组织块可随换液弃去。实验主要用4～6代细胞，后期细胞生长力衰减，实验效果不佳。
同样的方法培养SD大鼠、昆明小鼠、兔主动脉平滑肌细胞，三者比较，以兔的培养成活率较高，生长情况较好。早期冻存的细胞，复苏后继续生长传代，仍可用于实验。组织块贴壁法培养VSMCs直接从血管平滑肌中层获取细胞，缩短了培养周期，传代培养至3～4代，细胞纯度既已很高，无需酶消化等繁复的步骤，节约了大量人力物力，简便易行，经济可靠，可为心血管疾病防治及其病因机制研究提供良好的实验平台。（此文图1-3见附页2）
以
参考文献
［1］ Nakamura A，Isoyama S，Watanabe T，et al.Heterogeneous smooth muscle cell population derived from small and larger arteries［J］. Microvasc Res， 1998， 55 (1):14-28.
［2］ Man GT，Feng ZH.Improvement in the techniques of culturing and purifying pig，human，and rat endothelial cells and smooth muscle cells［J］.Chin J Histochem Cytochem，2001，10(2):123-128.
［3］ 李萍， 郑莲星，王伶，等.反复贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(46):9319-9321.
［4］ Chamley-Campbell J，Campbell GR，Ross R.The smooth muscle cell in culture ［J］.Physiol Rev， 1979， 59(1):1-61.
［5］ 毛昱嘉， 王文杰.胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞［J］.中国动脉硬化杂志，2004，12(6):729-731.