【摘要】 目的 探讨RUNX3基因表达和启动子甲基化在结肠癌发生发展过程中的作用及其临床意义。方法 采用RT-PCR方法检测RUNX3基因表达，用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测RUNX3基因启动子甲基化。结果 47例结肠癌中，癌旁肠粘膜、原发灶、肝转移灶中RUNX3表达阳性率分别为100%(47/47)、38.3%(18/47)、14.3%(1/7)。原发灶和肝转移灶中RUNX3表达明显降低(P&<0.01)。癌旁肠粘膜组织、癌原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化阳性率分别为10.6%(5/47)，44.7%(21/47)，57.1%(4/7)，3种组织RUNX3基因启动子甲基化率的差别有显著性意义(P&<0.01)。在7例出现肝转移者中发生RUNX3失活者6例，其中4例(66.7%) 存在RUNX3基因启动子甲基化。结论 RUNX3基因启动子甲基化和RUNX3蛋白表达在结肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著的差异，可能与结肠癌的发生发展有关。
【关键词】 结肠癌;RUNX3;DNA甲基化
Abstract：Objective To study the function and clinic significance of expression and methylation of RUNX3 gene in promoter region in the genesis and progress of colon cancer.Methods Methylation specific PCR was used to detect methylation of RUNX3 promoter region. Expression of RUNX3 was examined by RT-PCR. Results In 47 cases of colon cancer， RUNX3 expression was detected at 100% (47/47)，38.3% (18/47)，14.3% (1/7) in paratumoral mucous membrane， primary cancer foci and hepatic metastasis respectively. RUNX3 expression in primary foci and hepatic metastasis was lower than that in paratumoral mucous membrane (P&<0.01). Methylation of RUNX3 promoter in paratumour mucous membrane， primary foci and hepatic metastasis was found at 10.6% (5/47)，44.7% (21/47)，57.1% (4/7) (P&<0.01). In 7 cases of hepatic metastasis， 4 (57.1%) were found with RUNX3 promoter methylation. Conclusions Methylation of RUNX3 promoter leads to inhibition of RUNX3 gene in colon cancer.
Key words：colon cancer; RUNX3; DNA Methylation
RUNX3基因是近年来发现的抑癌基因，动物实验表明，RUNX3基因的缺失可引起胃肠粘膜上皮细胞的异常增殖。在人胃癌细胞中，RUNX3基因的表达显著下降，而且其失活的主要机制是启动子甲基化和基因丢失[1]。RUNX3基因是否在结肠癌的发病中起重要作用，目前尚不完全清楚。本研究中我们检测了结肠癌中RUNX3基因表达和启动子甲基化状态，探讨RUNX3基因启动子甲基化与RUNX3抑癌基因失活的关系及其对结肠癌发生发展的影响和意义。
1 材料与方法
1.1 标本
本研究共47例结肠癌患者，男26例，女21例，年龄31～78岁。47例中出现肝转移者7例，均经影像学、手术和病理学证实。
1.2 DNA和RNA的制备
取手术切除结肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶标本。标本保存于-80 ℃深低温冰箱。采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，Trizol法提取总RNA。
1.3 RUNX3基因表达的检测
RT-PCR方法检测RUNX3基因mRNA的表达。RUNX3上游引物：5′-GATGGCAGGCAATGACGA-3′，下游引物：5′-TGCTGAAGTGGCTTGTGGT-3′，扩增片段长度：353bp。GAPDH上游引物：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，扩增长度：208 bp。
1.4 DNA的亚硫酸氢钠修饰
在50 μL体积中加入DNA 1 μg，NaOH(终浓度0.2 M)，于37 ℃变性10 min，加新鲜配置的对二苯酚(10 mM)30 mL和亚硫酸氢钠(3 M)52 μL，50 ℃，16 h。用Wizard DNA纯化树脂纯化DNA，-20 ℃保存。
1.5 MSP分析RUNX3基因甲基化状态
采用MSP(methylation，specific PCR，MSP) 法对结肠癌RUNX3基因甲基化状态进行了检测。RUNX3甲基特异性引物，上游引物5′-CGTCGGGTTAGCGAGGTTTC-3′，下游引物5′-GCCGCTACCGCGAAAAACGA-3′。RUNX3未甲基化引物，上游引物5′-GTGGGTGGTTGTTGGGTTAGT-3′，下游引物5′-TCCTCAACCACCACTACCACA-3′。PCR反应总体积25 μL，其中含有经亚硫酸氢钠修饰后的DNA 3 μL，10×Ex Tag Buffer 2.5 μL，引物各1 μL，dNTP 2 μL，TaKaRa Ex Taq 0.5 μL。PCR 反应条件为首次95 ℃变性3 min，然后95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，共40个循环。取PCR产物5 μL，在2 %琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下照相。高云升：结肠癌中RUNX3基因表达和启动子甲基化及其临床意义辽宁医学院学报 2008年8月，29(4)
1.6 统计学分析
利用SPSS11.0软件对RUNX3 基因的启动子甲基化状况与临床病理资料之间进行统计学分析，采用χ2 (卡方) 检验分析不同组别RUNX3基因表达和RUNX3基因启动子甲基化的差别，当P&<0.05时被认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 RUNX3基因启动子甲基化在结肠癌的发生率
47例结肠癌患者中，在癌旁肠粘膜组织、癌原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化阳性率分别为10.6%(5/47)，44.7%(21/47)，57.1%(4/7)。癌旁肠粘膜、原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化率的差别有显著性意义(χ2=47.52，P&<0.01)。存在肝转移的患者中RUNX3启动子甲基化发生率最高。
2.2 RUNX3基因甲基化与临床病理的关系
本研究未发现RUNX3甲基化与浸润深度、淋巴结转移、组织分化程度等临床病理参数有显著的相关性。
2.3 RUNX3基因启动子甲基化与结肠癌RUNX3基因失活的关系
在47例结肠癌中，癌旁肠粘膜、原发癌灶、肝转移灶组织中RUNX3表达阳性率分别为100%(47/47)、38.3%(18/47)、14.3%(1/7)，原发癌灶和肝转移灶中RUNX3表达明显降低(χ2=23.4，P&<0.01)。在RUNX3失活的29例原发癌灶组织中，21例(72.4%)出现RUNX3基因启动子甲基化。在7例肝转移灶中发生RUNX3失活者6例，其中4例(66.7%) 存在RUNX3基因启动子甲基化。原发癌灶和肝转移灶之间RUNX3启动子甲基化在RUNX3基因失活所占比例的差异无显著性意义(χ2=0.57，P&>0.05)。
3 讨 论
目前的研究认为，DNA甲基化与肿瘤的发生及发展密切相关，尤其是肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛高甲基化更为重要。近年来，有关人类肿瘤细胞系或肿瘤组织中RUNX3表达下调的研究也渐有报道，如RUNX3在肝癌[2，3]、胃癌[4-6]、肺癌[7，8]等肿瘤中表达失活，而失活的机制主要为基因启动子区CpG岛高甲基化。本研究中47例结肠癌组织有21例(44.7%)标本检测到RUNX3基因启动子区CpG岛高甲基化，而仅在5例癌旁正常组织标本中发现甲基化，两者比较具有显著统计学差异(P&<0.01)，表明RUNX3基因启动子区高甲基化是结肠癌中常见的表观遗传事件，可能参与了结肠癌的发生发展过程。但本研究未发现RUNX3基因启动子区高甲基化与浸润深度、淋巴结转移、组织分化程度等临床病理资料之间存在显著相关性。
本研究还分析了RUNX3基因甲基化与该基因表达之间的关系。在正常癌旁粘膜中均可检测到RUNX3基因的表达，而在结肠癌组织中RUNX3表达明显降低。本研究结果表明，在癌组织中RUNX3甲基化的出现与其mRNA的表达下降是一致的。
RUNX3来自Runt结构域转录因子(Runt do-main transcription)，又被称病毒强化结合蛋白2/结合因子(PEBP2/CBF)。人类(runt-related transcription factor 3 gene)基因位于人类1号染色体的1p36。以往动物研究发现，RUNX3敲除小鼠(RUNX3-/-)的胃黏膜上皮较未敲除小鼠(RUNX3+/-)的明显地过度增生，而且RUNX3-/-小鼠胃黏膜上皮细胞对转化生长因子(TGF)-β诱导的生长抑制和凋亡作用不敏感[9，10]。提示RUNX3可能是与TGF-β介导的细胞生长和凋亡调控有关的重要抑癌基因。
我们的研究结果表明，RUNX3启动子区CpG岛的高甲基化在结肠癌的发病过程中是一常见表观遗传学事件，RUNX3 基因作为一个肿瘤抑制基因， 其表达下调参与了结直肠癌的发生、发展， 并可能与结直肠癌的浸润、分化和转移相关。进一步研究RUNX3在结肠癌发生发展过程中的作用将可能为结肠癌的诊断和治疗提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。
参考文献
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