作者：苏玉虹，张洋，朱弘焱，赵微，巴彩凤
【摘要】 目的 检测C3H/HeJ和C3H/SW小鼠感染肠出血性大肠杆菌(EHEC:O157)后肾细胞凋亡，并探讨thl4基因突变对肾细胞凋亡的影响。方法 流式细胞术(FCM)检测C3H/HeJ和C3H/SW小鼠感染EHEC:O157后肾细胞凋亡率，采用SPSS11.0统计软件分析结果。结果 C3H/HeJ小鼠肾细胞凋亡率明显高于C3H/SW小鼠，差异有统计学意义(P&<0.05)。结论 小鼠感染EHEC:O157后肾细胞凋亡与thl4基因突变相关。
【关键词】 小鼠;EHEC:O157;肾细胞;凋亡;流式细胞术
Abstract：Objective To detect apoptosis of renal cells in mice C3H/HeJ and C3H/SW infected with EHEC: O157 and to search for the effect of mutation of gene thl4 on apoptosis of renal cells.Methods The apoptosis of renal cells in mice infected with EHEC:O157 was detected by Flow Cytometry Method (FCM). The results were statistically analyzed by SPSS 10.0 software.Results The apoptosis rate of renal cells in C3H/HeJ mice was faster than that in C3H/SW mice. And the difference was significant.Conclusions The apoptosis of renal cells in mice infected with EHEC: O157 was associated with mutation of gene thl4.
Key words：mouse; EHEC: O157; renal cells; apoptosis; Flow Cytometry Method
目前，肾细胞凋亡与肾相关疾病的发生息息相关，肾细胞凋亡率的检测可作为多种疾病诊断的一项指标，其监测可对抵御机体的进一步感染起到重要作用。课题组使用流式细胞术(Flow cytometry method， FCM)检测thl4基因突变的C3H/HeJ小鼠与正常的C3H/SW小鼠的Th1/Th3类细胞因子含量及淋巴细胞亚群含量，结果表明突变小鼠的以上两种指标的含量均高于正常小鼠。本实验利用流式细胞术检测两种小鼠感染EHEC:O157后肾细胞的凋亡率，进一步探讨thl4基因突变与EHEC:O157敏感性的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂及仪器和软件
SPF级C3H/HeJ和C3H/SW，各20只，雌雄各半，体重(20±2) g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK((沪)20003-0003)。出血性大肠杆菌EHEC:O157(购于上海CCTCC公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(购于北京宝赛生物技术有限公司)。流式细胞仪，型号：FACSCaliburTM (美国BD公司)，及其CellQuest、BD CBA数据分析软件。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型建立及分组、取材
C3H/HeJ、C3H/SW小鼠各取20只，每天经口灌胃0.3 mL EHEC:O157菌液(菌液经LB液清洗)(A620nm≈0.40)。每天随机选取5只C3H/HeJ和5只C3H/SW小鼠，取其肾脏用于凋亡细胞的检测。
1.2.2 标本制备
新鲜肾脏在冰浴上剪碎，采用200目不锈钢网磨搓法制备单悬细胞，离心 300 g，5 min，PBS洗两遍;加1 mL PBS后计数，吸取1×106个细胞，离心 300 g，5 min，去上清，重悬细胞于200 μL Binding Buffer中，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min，再加入300 μL Binding Buffer，最后，用PBS配制的1%多聚甲醛悬起细胞，30 min内上机检测。
1.2.3 仪器调整
首先使用BD CaliBRITE Beads试剂通过BD FASComp软件设定仪器基本参数。检测及分析：30 min内使用BD CellQuest软件统计分析。
1.3 统计学分析
采用SPSS11.0统计软件，计数资料以 ±s表示，两组数据比较采用t检验，以P&<0.05为统计学显著性差异标准，检验水准设为α=0.05。苏玉虹，等：EHEC:O157感染后小鼠肾细胞凋亡的检测辽宁医学院学报 2008年8月，29(4)
2 结 果
经口腔灌胃感染EHEC:O157后，C3H/HeJ和C3H/SW小鼠肾脏细胞凋亡率明显增加，说明EHEC:O157分泌的内毒素对小鼠肾细胞有诱导凋亡作用，可能引起肾器官功能性的改变，最终导致尿毒症;其中在感染后第0、3天时，C3H/HeJ与C3H/SW 小鼠凋亡率未见明显差异，但在感染后第1、2 天时，C3H/HeJ 小鼠的肾脏细胞凋亡率明显高于C3H/SW小鼠，并具有统计学意义，说明基因突变的C3H/HeJ小鼠对EHEC:O157感染更敏感。表1 EHEC:O157感染后两种小鼠肾脏细胞凋亡率比较注: * 代表与C3H/SW组比较具有统计学意义(P&<0.05)
3 讨 论
肠出血性大肠杆菌 (Entero- hemorrhagic E.coli， EHEC )是致泻性大肠杆菌的一种，其中以O157:H7为代表的EHEC引起的急性肾功能衰竭和溶血性尿毒综合症在世界范围内曾引起多次爆发和多人死亡[1]。近年有研究资料表明：TLR4介导G-菌的LPS信号传导，起到宿主第一道防线的作用，因此被称为天然免疫基因。内毒素是与EHEC 致病有关的因子，而EHEC细胞壁的脂多糖(LPS)是内毒素的主要组分(机体在受到EHEC:O157 感染时，LPS作用于细胞膜受体 [2-4] )，耐热的脂类A是多糖的毒性部分。尽管内毒素引起的是非特异性反应，但内毒素血症可致使内皮细胞对志贺样毒素敏感，促进细胞因子释放而加重结肠炎。曾有文献报道[5]：EHEC:O157主要通过细菌对上皮细胞的粘附及产生毒素两个过程导致腹泻、肾炎等病理性改变。EHEC:O157 感染具有多种治病因子，目前流行病学研究认为由EHEC:O157 导致的出血性肠炎及溶血性尿毒综合症不仅与细菌感染程度有关而且与遗传因素有关，存在个体差异。
C3H/HeJ小鼠是Tlr4基因突变小鼠，即Tlr4的胞内区第712位的脯氨酸残基被组氨酸取代，导致Tlr4受体结构域改变，使C3H/HeJ小鼠对LPS识别障碍，对G-菌的感染敏感，其原因可能是由于跨膜信号转导的障碍破坏了宿主免疫细胞识别病原微生物的能力，使机体无法及时清除或杀灭病原菌，最终导致感染失控。
本研究发现Tlr4基因突变小鼠C3H/HeJ小鼠感染EHEC:O157后，肾细胞凋亡率比C3H/SW小鼠高，说明Tlr4基因突变的C3H/HeJ小鼠对EHEC:O157敏感性高于C3H/SW小鼠，此结果与Th1/Th3类细胞因子含量及淋巴细胞亚群的含量的检测指标一致。本实验研究结果进一步证明Tlr4 基因可能为EHEC:O157的易感基因之一。
参考文献
[1] Li Hongwei，Jing Huaiqi，Pang bo，et al.Study on diarrhea disease caused by enterohemorrhagic Eschirichia coli O157:H7 in Xuzhou city [J].Chin J Epidemiol，2002，23(2):119-122.
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