作者：王继红，刘学政，杨雪佳
【摘要】 目的 探讨STZ尾静脉不同给药方法和补造模时不同给药剂量致大鼠糖尿病成模状况的差异。方法 本实验通过尾静脉不同的给药方法(非盐水导入组、盐水导入组)以建立大鼠糖尿病模型。以及未成模的大鼠给予不同剂量的STZ补造模(全量组、2/3全量组)。观察给药后大鼠成模情况、一般状况及检测各组成模后3 d、4 w、8 w血糖值的变化。结果 盐水导入方法可以大幅度降低STZ尾静脉注射造模时的死亡率(6.52%)，并提高成模率(73.9%)。补造模时2/3剂量组死亡率降低(6.67%，P&<0.05)且成模后血糖各组间，各时间点无差异(P&>0.05)。结论 盐水导入的尾静脉给药方法是注射链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的最佳途径，补造模时以2/3剂量为宜。
【关键词】 链脲佐菌素;盐水导入法;糖尿病模型;大鼠
Empirical Skills of Establishing Type 1 Diabetie Model Rat by InjectionThrough Vena Caudalis StreptozotocinWANG Jihong1， LIU Xuezheng2， YANG Xuejia2(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine ，Shenyang 110032 China;2.Liaoning Medical University， Jinzhou 121000 China)Abstract: Objective To explore the impact on induction of diabetes in rat models with different STZ administration and dosage. Methods SD rats received caudal vein injection of STZ to induce diabetes， with or without saline preceding the STZ injection. The impact of different additional amounts of STZ on the induction of diabetic model was also observed. The percentage of diabetic models， general condition and the blood glucose were determined on 3d， 4w and 8w after STZ injection. Results The method of saline usage significantly decreased the mortality(6.52%) and increased the percentage of diabetic models(73.9%). The additional amount of STZ had its lowest mortality (6.67%) when 2/3 routine amount was used， meanwhile the differences of blood glucose remained no significant compared with the control group. Conclusions The administration of saline preceding STZ injection is better than STZ injection alone， and if necessary， a 2/3 additional amount of STZ should be used.
Key words:streptozotocin; importing with liquor natrii chloride; diabetie model; rats
近几十年来，随着生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病患病率出现世界性的上升趋势，对人群总体健康的危害程度已居慢性非传染性疾病的第3位[1]。目前，糖尿病及其并发症的病因、发病机理尚未完全阐明，其预防和治疗措施仍不完善，因此，建立较理想的动物模型来研究该病的发病机制、预防和治疗具有重要意义。
自1960年开始利用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱发动物糖尿病模型以来[2]，STZ已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。STZ的给药途径常分为腹腔注射和尾静脉注射，因为尾静脉注射较之腹腔注射具有用药量少，且成模率高的特点，我课题组多采用此方法制备1型糖尿病大鼠的模型[3]，笔者通过多次反复造模，总结出一些实用的实验技巧，现将方法报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康成年雄性 (SD)大鼠104 只(辽宁医学院实验动物中心提供)，约8～12 周龄，体重为180～220 g，在普通环境下(通风，恒温18～23 ℃，湿度60%)饲养，喂饲普通饲料，自由饮水。
1.2 实验仪器和材料
链脉佐菌素(STZ)，Sigma公司。微量快速血糖仪OneTouch-ll型，美国强生公司。血糖试纸，美国强生公司。尿糖试纸，广州市珠江生化试剂公司。MPZOOB电子天平，上海天普分析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型的制备
将实验用大鼠用电子天平称量体重， STZ按45 mg/kg体重称取后，溶解于pH值4.5，浓度为0.1 mol/L的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，配制成2%的溶液，过滤器除菌，将禁食12 h的大鼠尾静脉注射，观察2 h，开始饮食。3 d后取尾静脉尖血用OneTouchll型血糖仪检测血糖，并同时测尿糖。以尿糖(+++)以上，空腹血糖16.5 mmol/L以上，出现多尿、多饮、多食症状的大鼠即为造模成功的糖尿病大鼠。实验期间大鼠正常饮食水。未成模的大鼠于7 d后再次尾静脉注射STZ。
1.3.2 实验分组
实验一：非盐水导入组：2%STZ溶液直接尾静脉推入;盐水导入组：尾静脉给药前先用0.35 mL的盐水导入，然后再推2%STZ溶液。
实验二：未成模的大鼠再次补药，分为：全量组：按体重全量静脉注射STZ溶液补药;2/3全量组：按2/3全量尾静脉注射STZ溶液补药。
1.4 观察指标
观察造模后各组的成活数量的变化，大鼠的一般状态、摄食量、饮水量及排尿量;监测3 d、4 w、8 w血糖的变化。
1.5 数据处理
数据以±s表示，均数间比较采用χ2检验及重复测量方差分析，全部统计在SPSS13.0软件上进行。
2 结 果
2.1 造模结果 两组间比较P&<0.01，说明盐水导入方法可以明显提高大鼠成活率(73.9%)，而在非盐水导入组大鼠的死亡率很高(48.3%)，严重影响了成模率(39.6%)，予以盐水导入后大鼠的成活率和成模率明显提高，死亡率降至6.52%(表1)。表1 各组大鼠成模状况χ2=21.435 两组间比较P&<0.01
当第一次造模未成功时需要补造模，实验结果表明，全量组与2/3全量组比较，两组间无统计学差异。此时给与全量的2/3的STZ，就可达到较高(80%)的成模率，且大鼠死亡率也极低(6.67%)见(表2)。表2 补药组大鼠成模状况χ2=3.772 两组间比较P&>0.05
2.2 大鼠的一般状况
随着病程的进展，实验组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、搔痒、毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少和易感染等表现，2只出现烂尾。6只出现上呼吸道感染，观察12 w，实验组大鼠体重减轻20%，饮水量增加近3倍。
2.3 血糖的变化
分别于3 d、4 w、8 w取尾血检测血糖，各时间点各组间血糖值无显著差异性(P&>0.05)，说明成模后血糖稳定，各组均无明显血糖回退现象(见表3)。表3 造模前后血糖表(mmol/L) 造模后各时间点、各组间比较P&>0.05
3 讨 论
国内外大量的实验研究表明[4，5]，1型糖尿病的发病机制主要是由于Th1细胞(1型T辅助淋巴细胞)介导细胞免疫应答破坏胰岛β细胞，在发病后期，逐渐转为Th3细胞(1型T辅助淋巴细胞)介导的体液免疫应答，对Th1细胞产生抑制作用，使对胰岛细胞的破坏具有减轻作用。一旦T细胞凋亡发生障碍未被清除而存活下来，在一定条件下就会发生自身免疫性疾病[6，7]。以往研究表明，链脲佐菌素致动物血糖升高，主要是选择性损伤胰岛β细胞，导致体内胰岛素分泌绝对不足。引起血糖水平改变分为3个时相，早期高血糖，持续约1～2 h，继而因胰岛β细胞破坏，大量胰岛素释放引起低血糖，持续约6～10 h，24 h后开始持久稳定的高血糖状态[8]。
本实验非盐水导入组动物死亡率极高，影响成模率，因此在此基础上改良用盐水导入，即及在STZ推入前头皮针的导管内抽入盐水针头刺入尾静脉回血后再接入抽有STZ的注射器。因STZ的溶液pH值偏酸，因此进入大鼠血管后对血管有较强的刺激性，用盐水导入后一方面可以节省药物不必要的浪费，另一方面可减小对血管的刺激性，并对注入血管内的STZ浓度有适度的缓冲作用。实践证明其的确能减低STZ的细胞毒性，降低大鼠的死亡率，从而提高其成模率，从两组未成模率来看(P&>0.05)两组并无统计学差异，因此用盐水导入STZ的确是提高成模率、降低实验成本行之有效的办法。
本实验还通过再次补造模的实践总结出，补造模时，使用2/3全量的STZ溶液，即可达到成模的效果，两组成模率(P&>0.05)无统计学差异，死亡率明显减低(P&<0.05)。此结果与文献上已有研究结果显示[9，10]，以小剂量多次注射STZ的方法建立的1型糖尿病动物模型的结论相类似，但不同的是再次给药的时间点和计量有所不同。其机理，可能与用低剂量的STZ处理易感动物导致胰岛细胞的持续性破坏，自身抗原的释放，诱导自身反应细胞克服了免疫系统的自我耐受，打破了机体的免疫自稳状态，发生针对胰岛细胞的自身免疫反应，引起对胰岛细胞的破坏效应。自身抗原成分的进一步释放，进一步促进免疫应答的发生，造成稳定持久的1型糖尿病的发生[11]。改良方法后，STZ成模率已基本与一些文献报道的可达80%～90%的成模率[12]相接近。
笔者通过长时间喂养糖尿病大鼠，还总结出几点经验：(1)造模前大鼠应适应性喂养1 周左右，体重维持在180～220 g之间，保持良好的营养状态;(2)STZ和柠檬酸缓冲溶液必须低温保存，新鲜配制，短时间内用完;(3)大鼠禁食应达到12 h，空腹可提高成模率[3]，注射STZ后，应观察2小时左右，给予充足饮水及食物;(4)饲养室内通风良好，氨浓度小于20 ppm，相对湿度为40%～70%，室温保持在18～25 ℃。必须保持温度和湿度的相对稳定，否则大鼠极易患上呼吸道感染或肺内感染;(5)因糖尿病大鼠排尿很多一天至少换1～2次垫料，以保持其干爽，减少疾病的发生;(6)尾静脉采血部位可涂以皮炎平软膏，防止感染效果很好。
参考文献
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